Introduktion
L-phenylacetylcarbinol er en forbindelse, der bruges i syntesen af efedrin, der i sig selv bruges som forstadie til amfetamin. Industrielt syntetiseres det ved aerob fermentering af benzaldehyd i bagegær (S. cerevisiae/SC). Selv om processen er ret enkel, kan den kræve en smule udstyr og viden, især når man taler om at opretholde sterile kulturer og korrekte vækstbetingelser. Jeg vil derfor forklare to metoder af forskellig sværhedsgrad til produktion af L-PAC gennem biotransformation. Vækstmediet skal steriliseres ved autoklavering før brug.
Den første metode:
Man kan beskrive denne teknik som "sjusket, men nem". Den kræver mindre udstyr, er nemmere, men er også mindre effektiv og vil resultere i lavere udbytte.
Fremgangsmåde:
I 500 ml steril 0,1 M pH 6 citratbuffer tilsættes 44 g gær og 55 g glukose. Anbring i et vandbad opvarmet til 30 °C. Inkuber i 40/50 minutter.
Tilsæt benzaldehyd (25 mmol) i 5 mL ethanol og acetaldehyd (25 mmol). Inkubér i 60 minutter.
Filtrer gennem Celite.
Ekstraher med 3*100 ml ethylacetat. Bryd emulsionen med mættet natriumkloridopløsning, tør over vandfrit natriumsulfat, filtrer, inddamp opløsningsmidlet. Dette er din L-PAC.
Forklaringer:
Citratbuffer: Denne bruges til at opretholde en stabil pH-værdi, da cellens vækst vil sænke den over tid (ikke godt). For at forberede denne buffer skal du følge procedurerne i denne beregner: https://www.aatbio.com/resources/buffer-preparations-and-recipes/citrate-buffer-ph-3-to-6-2. Glem ikke at ændre pH-værdien til 6.
Temperatur: Tillader højere metabolisk aktivitet hos gæren.
Ethanol: bruges til at opløse benzaldehyd og acetaldehyd og øger deres biotilgængelighed.
Acetaldehyd: bruges som hydrogenacceptor i stedet for benzaldehyd, hvilket begrænser produktionen af benzylalkohol.
Det er en nem procedure, som næsten alle kan følge efter at have læst lidt om sterile standardteknikker, men den giver et lavere udbytte end den anden (mellem 20 og 40 %). Den kan forbedres enten ved at have bedre beluftning ved hjælp af enten orbitalrystning ved 150 o/min eller ved at pumpe steril luft ind i mediet med 1 liter luft pr. liter medium pr. minut eller ved at immobilisere cellerne i alginatperler. Du kan slå det op på YouTube, det er meget nemt at gøre, og det kan øge udbyttet betydeligt.
Den anden metode:
Denne protokol er mere avanceret, men kan øge udbyttet med op til 60 eller 70 %, hvis den udføres korrekt. Den kræver dog mere materiale. Selv om den ikke er perfekt, er den langt bedre.
Denne metode er designet til gæren Candida utilis i stedet for S. cerevisiae. Du kan bruge SC i stedet, men du vil se et fald i udbyttet. Du kan købe C. utilis her: https://www.biomall.in/product/candida-utilis-atcc-9950-0779p-0779p
Fremgangsmåde
Vækstmediet består af 10g/L urea (tilfører kvælstof), 10g/L MgSO4 (tilfører magnesium og svovl) og mellem 50 og 70g/L sukker fra melasse. Opløs i en passende mængde 0,1 M pH 6 citratbuffer.
Dagen før inokuleres en startkultur af gær, og der inkuberes ved 30 °C natten over.
Aflæs optisk tæthed (absorbans) ved 595 nm. Pod din fermenteringsreaktor med 15 % v/v af din startkultur justeret til 0,4 OD. Eksempel: For at inokulere en 1L beholder, hvis OD blev målt til 0,2, skal du tilføje 300 ml til 700 ml. Hvis OD allerede er på 0,4, tilsættes 150 ml til 850 ml osv... (240x106 celler/ml i inokulummet, se forklaringer).
Inkuber ved 30 °C med enten orbitalrystning ved 150 o/min eller pumpning af steril luft ved 1 v/v/min. Hvis du pumper luft, kan det være en god idé at tilføje lidt langsom omrøring.
Inkuber, indtil OD når mellem 0,3 og 0,4. Dette bør tage mellem 4 og 6 timer, kan være mindre eller mere. Tjek OD hvert 30. minut, indtil du når den ønskede værdi.
Tilsætningen af benzaldehyd sker i flere doser. For en 50 ml er mængderne 68, 62, 56, 50, 43, 37, 31, 25. Tilsæt en tilsvarende mængde acetaldehyd på samme tid. Vent en time mellem hver tilsætning.
Ekstraher med 1:2 toluen/medium v/v, inddamp.
Forklaring:
Optisk tæthed: Den måles med et spektrofotometer. Her aflæser vi absorbansen ved 595 nm, som er proportional med antallet af celler i opløsningen. Som tommelfingerregel skal du huske 0,1 OD=60x10^6 celler/mL.
Generelle bemærkninger:
Til beluftning er det bedre at ryste i kredsløb ved 150 o/min i lille skala. I større skala skal du boble luft gennem et filter.
I den anden protokol sker tilsætningen af benzaldehyd i flere doser for at øge udbyttet. Dette kan forbedres yderligere ved kontinuerligt at injicere benzaldehyd i faldende hastighed, men dette er komplekst at gøre i en amatørindstilling.
Substituerede benzaldehyder kan bruges og vil give den tilsvarende L-PAC-analog.
Endelig kan du låne nogle elementer fra metode 2 og indarbejde dem i metode 1 for at tilpasse forsøgsdesignet til din smag. Vær opmærksom på, at andre stammer og arter kan bruges, hvilket øger udbyttet betydeligt. Se "Production of L-phenyl Acetyl Carbinol (L-PAC) by different novel strains of yeasts in molasses and sugar cane juice as production medium" af Ravi et al for mere information.
L-phenylacetylcarbinol er en forbindelse, der bruges i syntesen af efedrin, der i sig selv bruges som forstadie til amfetamin. Industrielt syntetiseres det ved aerob fermentering af benzaldehyd i bagegær (S. cerevisiae/SC). Selv om processen er ret enkel, kan den kræve en smule udstyr og viden, især når man taler om at opretholde sterile kulturer og korrekte vækstbetingelser. Jeg vil derfor forklare to metoder af forskellig sværhedsgrad til produktion af L-PAC gennem biotransformation. Vækstmediet skal steriliseres ved autoklavering før brug.
Den første metode:
Man kan beskrive denne teknik som "sjusket, men nem". Den kræver mindre udstyr, er nemmere, men er også mindre effektiv og vil resultere i lavere udbytte.
Fremgangsmåde:
I 500 ml steril 0,1 M pH 6 citratbuffer tilsættes 44 g gær og 55 g glukose. Anbring i et vandbad opvarmet til 30 °C. Inkuber i 40/50 minutter.
Tilsæt benzaldehyd (25 mmol) i 5 mL ethanol og acetaldehyd (25 mmol). Inkubér i 60 minutter.
Filtrer gennem Celite.
Ekstraher med 3*100 ml ethylacetat. Bryd emulsionen med mættet natriumkloridopløsning, tør over vandfrit natriumsulfat, filtrer, inddamp opløsningsmidlet. Dette er din L-PAC.
Forklaringer:
Citratbuffer: Denne bruges til at opretholde en stabil pH-værdi, da cellens vækst vil sænke den over tid (ikke godt). For at forberede denne buffer skal du følge procedurerne i denne beregner: https://www.aatbio.com/resources/buffer-preparations-and-recipes/citrate-buffer-ph-3-to-6-2. Glem ikke at ændre pH-værdien til 6.
Temperatur: Tillader højere metabolisk aktivitet hos gæren.
Ethanol: bruges til at opløse benzaldehyd og acetaldehyd og øger deres biotilgængelighed.
Acetaldehyd: bruges som hydrogenacceptor i stedet for benzaldehyd, hvilket begrænser produktionen af benzylalkohol.
Det er en nem procedure, som næsten alle kan følge efter at have læst lidt om sterile standardteknikker, men den giver et lavere udbytte end den anden (mellem 20 og 40 %). Den kan forbedres enten ved at have bedre beluftning ved hjælp af enten orbitalrystning ved 150 o/min eller ved at pumpe steril luft ind i mediet med 1 liter luft pr. liter medium pr. minut eller ved at immobilisere cellerne i alginatperler. Du kan slå det op på YouTube, det er meget nemt at gøre, og det kan øge udbyttet betydeligt.
Den anden metode:
Denne protokol er mere avanceret, men kan øge udbyttet med op til 60 eller 70 %, hvis den udføres korrekt. Den kræver dog mere materiale. Selv om den ikke er perfekt, er den langt bedre.
Denne metode er designet til gæren Candida utilis i stedet for S. cerevisiae. Du kan bruge SC i stedet, men du vil se et fald i udbyttet. Du kan købe C. utilis her: https://www.biomall.in/product/candida-utilis-atcc-9950-0779p-0779p
Fremgangsmåde
Vækstmediet består af 10g/L urea (tilfører kvælstof), 10g/L MgSO4 (tilfører magnesium og svovl) og mellem 50 og 70g/L sukker fra melasse. Opløs i en passende mængde 0,1 M pH 6 citratbuffer.
Dagen før inokuleres en startkultur af gær, og der inkuberes ved 30 °C natten over.
Aflæs optisk tæthed (absorbans) ved 595 nm. Pod din fermenteringsreaktor med 15 % v/v af din startkultur justeret til 0,4 OD. Eksempel: For at inokulere en 1L beholder, hvis OD blev målt til 0,2, skal du tilføje 300 ml til 700 ml. Hvis OD allerede er på 0,4, tilsættes 150 ml til 850 ml osv... (240x106 celler/ml i inokulummet, se forklaringer).
Inkuber ved 30 °C med enten orbitalrystning ved 150 o/min eller pumpning af steril luft ved 1 v/v/min. Hvis du pumper luft, kan det være en god idé at tilføje lidt langsom omrøring.
Inkuber, indtil OD når mellem 0,3 og 0,4. Dette bør tage mellem 4 og 6 timer, kan være mindre eller mere. Tjek OD hvert 30. minut, indtil du når den ønskede værdi.
Tilsætningen af benzaldehyd sker i flere doser. For en 50 ml er mængderne 68, 62, 56, 50, 43, 37, 31, 25. Tilsæt en tilsvarende mængde acetaldehyd på samme tid. Vent en time mellem hver tilsætning.
Ekstraher med 1:2 toluen/medium v/v, inddamp.
Forklaring:
Optisk tæthed: Den måles med et spektrofotometer. Her aflæser vi absorbansen ved 595 nm, som er proportional med antallet af celler i opløsningen. Som tommelfingerregel skal du huske 0,1 OD=60x10^6 celler/mL.
Generelle bemærkninger:
Til beluftning er det bedre at ryste i kredsløb ved 150 o/min i lille skala. I større skala skal du boble luft gennem et filter.
I den anden protokol sker tilsætningen af benzaldehyd i flere doser for at øge udbyttet. Dette kan forbedres yderligere ved kontinuerligt at injicere benzaldehyd i faldende hastighed, men dette er komplekst at gøre i en amatørindstilling.
Substituerede benzaldehyder kan bruges og vil give den tilsvarende L-PAC-analog.
Endelig kan du låne nogle elementer fra metode 2 og indarbejde dem i metode 1 for at tilpasse forsøgsdesignet til din smag. Vær opmærksom på, at andre stammer og arter kan bruges, hvilket øger udbyttet betydeligt. Se "Production of L-phenyl Acetyl Carbinol (L-PAC) by different novel strains of yeasts in molasses and sugar cane juice as production medium" af Ravi et al for mere information.
