Въведение
L-фенилацетилкарбинолът е съединение, използвано в синтеза на ефедрин, който сам по себе си се използва като прекурсор на амфетамините. Промишлено той се синтезира чрез аеробна ферментация на бензалдехид от хлебни дрожди (S. cerevisiae/SC). Въпреки че процесът е доста прост, той може да изисква известно оборудване и познания, особено когато става дума за поддържане на стерилни култури и подходящи условия на растеж. Затова ще обясня два метода с различна сложност за производство на L-PAC чрез биотрансформация. Преди употреба растежната среда трябва да се стерилизира чрез автоклавиране.
Първи метод:
Този метод може да се опише като "небрежен, но лесен". Тя изисква по-малко оборудване, по-лесна е, но е и по-малко ефективна и ще доведе до по-ниски добиви.
Процедура:
В 500 ml стерилен цитратен буфер с рН 6 се добавят 44 g дрожди и 55 g глюкоза. Поставете на водна баня, загрята на 30°C. Инкубира се за 40/50 минути.
Добавят се бензалдехид (25 mmol) в 5 ml етанол и ацеталдехид (25 mmol). Инкубира се в продължение на 60 минути.
Филтрира се през целит.
Екстрахира се с 3*100 ml етилацетат. Разбийте емулсията с помощта на наситен разтвор на натриев хлорид, изсушете над безводен натриев сулфат, филтрирайте, изпарете разтворителя. Това е вашият L-PAC.
Обяснения:
Цитратен буфер: използва се за поддържане на стабилно рН, тъй като растежът на клетката ще го понижи с течение на времето (което не е добре). За да приготвите този буфер, следвайте процедурите, дадени от този калкулатор: https://www.aatbio.com/resources/buffer-preparations-and-recipes/citrate-buffer-ph-3-to-6-2. Не забравяйте да промените pH на 6.
Температура: позволява по-висока метаболитна активност на дрождите.
Етанол: използва се за разтваряне на бензалдехида и ацеталдехида и повишава тяхната бионаличност.
Ацеталдехид: използва се като водороден акцептор вместо бензалдехид, като по този начин се ограничава производството на бензилов алкохол.
Това е лесна процедура, която почти всеки може да следва след малко четене на стандартни стерилни техники, но дава по-ниски добиви от другата (между 20 и 40 %). Тя може да бъде подобрена или чрез по-добро аериране, като се използва или орбитално разклащане при 150 об/мин, или чрез изпомпване на стерилен въздух в средата, с 1 л въздух на литър среда в минута, или чрез имобилизиране на клетките в алгинатни топчета. Можете да потърсите това в youtube, много е лесно да се направи и може да увеличи значително добивите.
Втори метод:
Този протокол е по-усъвършенстван, но може да увеличи добивите до 60 или 70 %, ако се направи правилно. Той обаче изисква повече материал. Въпреки че не е съвършен, той е много по-добър.
Този метод е разработен за дрождите Candida utilis вместо за S. cerevisiae. Можете да използвате SC вместо него, но ще видите намаляване на добивите. Можете да закупите C. utilis тук: https: //www.biomall.in/product/candida-utilis-atcc-9950-0779p-0779p
Процедура
Средата за растеж се състои от 10 g/L урея (внася азот), 10 g/L MgSO4 (внася магнезий и сяра) и между 50 и 70 g/L захар, като се използва меласа. Разтваря се в подходящ обем 0,1М цитратен буфер с рН 6.
В деня преди това се инокулира начална култура дрожди и се инкубира при 30 °C за една нощ.
Отчита се оптичната плътност (абсорбция) при 595 nm. Инокулирайте ферментационния си реактор с 15% v/v от изходната култура, коригирана до 0,4 OD. Пример: за инокулиране на контейнер от 1 л, ако е измерена OD 0,2, добавете 300 мл към 700 мл. Ако OD вече е 0,4, добавете 150mL към 850mL и т.н. (240x106 клетки/ml в инокулума, вижте обясненията)
Инкубирайте при 30°C с орбитално разклащане при 150 об/мин или с изпомпване на стерилен въздух със скорост 1 v/v/min. Ако се изпомпва въздух, може да искате да добавите малко бавно разбъркване.
Инкубирайте до достигане на OD между 0,3 и 0,4. Това трябва да отнеме между 4 и 6 часа, може да е по-малко или повече. Проверявайте OD на всеки 30 минути, докато достигнете желаната стойност.
Добавянето на бензалдехид се извършва на няколко дози. За 50 ml обемите са 68, 62, 56, 50, 43, 37, 31, 25. Добавете еквивалентен обем ацеталдехид по същото време. Изчакайте един час между всяко добавяне.
Екстрахирайте, като използвате 1:2 толуен/медиум v/v, изпарете.
Обяснение:
Оптична плътност: измерва се със спектрофотометър. Тук отчитаме абсорбцията при 595 nm, която е пропорционална на броя на клетките в разтвора. Като правило, запомнете, че 0,1 OD=60x10^6 клетки/ml
Общи бележки:
За аериране в малък мащаб е по-добре да се използва орбитално разклащане при 150 об/мин. В по-голям мащаб ще трябва да се използва въздух, преминал през филтър.
Във втория протокол добавянето на бензалдехид се извършва в няколко дози, за да се увеличи добивът. Това може да се подобри допълнително чрез непрекъснато впръскване на бензалдехид с намаляваща скорост, но това е сложно да се направи в любителски условия.
Могат да се използват заместени бензалдехиди, от които ще се получи съответният аналог на L-PAC.
И накрая, можете да заимствате някои елементи от метод 2 и да ги включите в метод 1, за да адаптирате експерименталния план по свой вкус. Имайте предвид, че могат да се използват други щамове и видове, което значително увеличава добивите. За повече информация вижте "Производство на L-фенил ацетил карбинол (L-PAC) от различни нови щамове дрожди в меласа и сок от захарна тръстика като производствена среда" от Ravi et al.
L-фенилацетилкарбинолът е съединение, използвано в синтеза на ефедрин, който сам по себе си се използва като прекурсор на амфетамините. Промишлено той се синтезира чрез аеробна ферментация на бензалдехид от хлебни дрожди (S. cerevisiae/SC). Въпреки че процесът е доста прост, той може да изисква известно оборудване и познания, особено когато става дума за поддържане на стерилни култури и подходящи условия на растеж. Затова ще обясня два метода с различна сложност за производство на L-PAC чрез биотрансформация. Преди употреба растежната среда трябва да се стерилизира чрез автоклавиране.
Първи метод:
Този метод може да се опише като "небрежен, но лесен". Тя изисква по-малко оборудване, по-лесна е, но е и по-малко ефективна и ще доведе до по-ниски добиви.
Процедура:
В 500 ml стерилен цитратен буфер с рН 6 се добавят 44 g дрожди и 55 g глюкоза. Поставете на водна баня, загрята на 30°C. Инкубира се за 40/50 минути.
Добавят се бензалдехид (25 mmol) в 5 ml етанол и ацеталдехид (25 mmol). Инкубира се в продължение на 60 минути.
Филтрира се през целит.
Екстрахира се с 3*100 ml етилацетат. Разбийте емулсията с помощта на наситен разтвор на натриев хлорид, изсушете над безводен натриев сулфат, филтрирайте, изпарете разтворителя. Това е вашият L-PAC.
Обяснения:
Цитратен буфер: използва се за поддържане на стабилно рН, тъй като растежът на клетката ще го понижи с течение на времето (което не е добре). За да приготвите този буфер, следвайте процедурите, дадени от този калкулатор: https://www.aatbio.com/resources/buffer-preparations-and-recipes/citrate-buffer-ph-3-to-6-2. Не забравяйте да промените pH на 6.
Температура: позволява по-висока метаболитна активност на дрождите.
Етанол: използва се за разтваряне на бензалдехида и ацеталдехида и повишава тяхната бионаличност.
Ацеталдехид: използва се като водороден акцептор вместо бензалдехид, като по този начин се ограничава производството на бензилов алкохол.
Това е лесна процедура, която почти всеки може да следва след малко четене на стандартни стерилни техники, но дава по-ниски добиви от другата (между 20 и 40 %). Тя може да бъде подобрена или чрез по-добро аериране, като се използва или орбитално разклащане при 150 об/мин, или чрез изпомпване на стерилен въздух в средата, с 1 л въздух на литър среда в минута, или чрез имобилизиране на клетките в алгинатни топчета. Можете да потърсите това в youtube, много е лесно да се направи и може да увеличи значително добивите.
Втори метод:
Този протокол е по-усъвършенстван, но може да увеличи добивите до 60 или 70 %, ако се направи правилно. Той обаче изисква повече материал. Въпреки че не е съвършен, той е много по-добър.
Този метод е разработен за дрождите Candida utilis вместо за S. cerevisiae. Можете да използвате SC вместо него, но ще видите намаляване на добивите. Можете да закупите C. utilis тук: https: //www.biomall.in/product/candida-utilis-atcc-9950-0779p-0779p
Процедура
Средата за растеж се състои от 10 g/L урея (внася азот), 10 g/L MgSO4 (внася магнезий и сяра) и между 50 и 70 g/L захар, като се използва меласа. Разтваря се в подходящ обем 0,1М цитратен буфер с рН 6.
В деня преди това се инокулира начална култура дрожди и се инкубира при 30 °C за една нощ.
Отчита се оптичната плътност (абсорбция) при 595 nm. Инокулирайте ферментационния си реактор с 15% v/v от изходната култура, коригирана до 0,4 OD. Пример: за инокулиране на контейнер от 1 л, ако е измерена OD 0,2, добавете 300 мл към 700 мл. Ако OD вече е 0,4, добавете 150mL към 850mL и т.н. (240x106 клетки/ml в инокулума, вижте обясненията)
Инкубирайте при 30°C с орбитално разклащане при 150 об/мин или с изпомпване на стерилен въздух със скорост 1 v/v/min. Ако се изпомпва въздух, може да искате да добавите малко бавно разбъркване.
Инкубирайте до достигане на OD между 0,3 и 0,4. Това трябва да отнеме между 4 и 6 часа, може да е по-малко или повече. Проверявайте OD на всеки 30 минути, докато достигнете желаната стойност.
Добавянето на бензалдехид се извършва на няколко дози. За 50 ml обемите са 68, 62, 56, 50, 43, 37, 31, 25. Добавете еквивалентен обем ацеталдехид по същото време. Изчакайте един час между всяко добавяне.
Екстрахирайте, като използвате 1:2 толуен/медиум v/v, изпарете.
Обяснение:
Оптична плътност: измерва се със спектрофотометър. Тук отчитаме абсорбцията при 595 nm, която е пропорционална на броя на клетките в разтвора. Като правило, запомнете, че 0,1 OD=60x10^6 клетки/ml
Общи бележки:
За аериране в малък мащаб е по-добре да се използва орбитално разклащане при 150 об/мин. В по-голям мащаб ще трябва да се използва въздух, преминал през филтър.
Във втория протокол добавянето на бензалдехид се извършва в няколко дози, за да се увеличи добивът. Това може да се подобри допълнително чрез непрекъснато впръскване на бензалдехид с намаляваща скорост, но това е сложно да се направи в любителски условия.
Могат да се използват заместени бензалдехиди, от които ще се получи съответният аналог на L-PAC.
И накрая, можете да заимствате някои елементи от метод 2 и да ги включите в метод 1, за да адаптирате експерименталния план по свой вкус. Имайте предвид, че могат да се използват други щамове и видове, което значително увеличава добивите. За повече информация вижте "Производство на L-фенил ацетил карбинол (L-PAC) от различни нови щамове дрожди в меласа и сок от захарна тръстика като производствена среда" от Ravi et al.
