Úvod
L-fenylacetylkarbinol je sloučenina používaná při syntéze efedrinu, který se sám používá jako prekurzor amfetaminů. Průmyslově se syntetizuje aerobní fermentací benzaldehydu pomocí pekařských kvasinek (S. cerevisiae/SC). I když je tento proces poměrně jednoduchý, může vyžadovat určité vybavení a znalosti, zejména pokud jde o udržování sterilních kultur a správných růstových podmínek. Vysvětlím proto dvě různě sofistikované metody výroby L-PAC biotransformací. Kultivační médium by mělo být před použitím sterilizováno autoklávováním.
První metoda:
Tuto techniku lze označit jako "nedbalou, ale snadnou". Vyžaduje méně vybavení, je jednodušší, ale je také méně účinná a povede k nižším výtěžkům.
Postup:
Do 500 ml sterilního 0,1M citrátového pufru o pH 6 přidejte 44 g kvasinek a 55 g glukózy. Umístěte do vodní lázně zahřáté na 30 °C. Inkubujte 40/50 minut.
Přidejte benzaldehyd (25 mmol) v 5 ml ethanolu a acetaldehyd (25 mmol). Inkubujte 60 minut.
Přefiltrujte přes celit.
Extrahujte 3*100 ml ethylacetátu. Emulze se rozbije nasyceným roztokem chloridu sodného, vysuší se nad bezvodým síranem sodným, zfiltruje se, rozpouštědlo se odpaří. Toto je váš L-PAC.
Vysvětlivky:
Citrátový pufr: používá se k udržení stabilního pH, protože růst buňky ho přes čas snižuje (což není dobré). Pro přípravu tohoto pufru postupujte podle postupů uvedených v této kalkulačce: https://www.aatbio.com/resources/buffer-preparations-and-recipes/citrate-buffer-ph-3-to-6-2. Nezapomeňte změnit pH na 6.
Teplota: umožňuje vyšší metabolickou aktivitu kvasinek.
Ethanol: používá se k rozpuštění benzaldehydu a acetaldehydu a zvyšuje jejich biologickou dostupnost.
Acetaldehyd: používá se jako akceptor vodíku místo benzaldehydu, čímž se omezuje produkce benzylalkoholu.
Jedná se o snadný postup, který může po troše čtení o standardních sterilních technikách provádět téměř každý, ale dává nižší výtěžky než druhý postup (mezi 20 a 40 %). Lze jej zlepšit buď lepším provzdušňováním pomocí orbitálního třepání při 150 otáčkách za minutu nebo pumpováním sterilního vzduchu do média, a to 1 litrem vzduchu na litr média za minutu, nebo imobilizací buněk v alginátových kuličkách. Můžete si to najít na youtube, je to velmi snadné a může to výrazně zvýšit výtěžnost.
Druhá metoda:
Tento protokol je pokročilejší, ale při správném postupu může zvýšit výtěžnost až o 60 nebo 70 %. Bude však vyžadovat více materiálu. I když není dokonalý, je mnohem lepší.
Tato metoda byla navržena pro kvasinky Candida utilis místo S. cerevisiae. Místo ní můžete použít SC, ale dojde ke snížení výtěžku. Kvasinku C. utilis můžete zakoupit zde: https://www.biomall.in/product/candida-utilis-atcc-9950-0779p-0779p.
Postup
Růstové médium se skládá z 10 g/l močoviny (přináší dusík), 10 g/l MgSO4 (přináší hořčík a síru) a 50 až 70 g/l cukru pomocí melasy. Rozpusťte v přiměřeném objemu 0,1M citrátového pufru o pH 6.
Den předem naočkujte výchozí kulturu kvasinek a inkubujte přes noc při 30 °C.
Odečtěte optickou hustotu (absorbanci) při 595 nm. Naočkujte fermentační reaktor 15% v/v výchozí kultury upravenou na OD 0,4. Příklad: Chcete-li naočkovat nádobu o objemu 1 l, pokud byla naměřena OD 0,2, přidejte 300 ml na 700 ml. Pokud je OD již 0,4, přidejte 150 ml na 850 ml atd... (240x106 buněk/ml v inokulaci, viz vysvětlivky).
Inkubujte při teplotě 30 °C s orbitálním třepáním při 150 otáčkách za minutu nebo s čerpáním sterilního vzduchu rychlostí 1 v/v/min. Pokud čerpáte vzduch, možná budete chtít přidat pomalé míchání.
Inkubujte, dokud OD nedosáhne hodnoty 0,3 až 0,4. To by mělo trvat 4 až 6 hodin, může to být méně nebo více. Každých 30 minut kontrolujte OD, dokud nedosáhnete požadované hodnoty.
Přídavek benzaldehydu se provádí v několika dávkách. Pro 50 ml jsou to objemy 68, 62, 56, 50, 43, 37, 31, 25. Současně přidejte ekvivalentní objem acetaldehydu. Mezi jednotlivými přídavky počkejte jednu hodinu.
Extrahujte za použití poměru 1:2 toluen/medium v/v, odpařte.
Vysvětlení:
Optická hustota: měří se pomocí spektrofotometru. Zde odečítáme absorbanci při 595 nm, která je úměrná počtu buněk v roztoku. Jako pravidlo si pamatujte, že 0,1 OD=60x10^6 buněk/ml.
Obecné poznámky:
Pro provzdušnění je v malém měřítku lepší orbitální třepání při 150 otáčkách za minutu. Ve větším měřítku budete potřebovat bublinkový vzduch procházející filtrem.
Ve druhém protokolu se přidání benzaldehydu provádí v několika dávkách, aby se zvýšily výtěžky. To lze dále zlepšit průběžným vstřikováním benzaldehydu v klesajícím poměru, ale to je v amatérském prostředí složité.
Lze použít substituované benzaldehydy a získat odpovídající analog L-PAC.
Nakonec si můžete vypůjčit některé prvky metody 2 a začlenit je do metody 1, abyste si přizpůsobili experimentální plán podle svých představ. Uvědomte si, že lze použít i jiné kmeny a druhy, což výrazně zvýší výtěžky. Další informace naleznete v článku "Production of L-phenyl Acetyl Carbinol (L-PAC) by different novel strains of yeasts in melasses and sugar cane juice as production medium" od Raviho a kol.
L-fenylacetylkarbinol je sloučenina používaná při syntéze efedrinu, který se sám používá jako prekurzor amfetaminů. Průmyslově se syntetizuje aerobní fermentací benzaldehydu pomocí pekařských kvasinek (S. cerevisiae/SC). I když je tento proces poměrně jednoduchý, může vyžadovat určité vybavení a znalosti, zejména pokud jde o udržování sterilních kultur a správných růstových podmínek. Vysvětlím proto dvě různě sofistikované metody výroby L-PAC biotransformací. Kultivační médium by mělo být před použitím sterilizováno autoklávováním.
První metoda:
Tuto techniku lze označit jako "nedbalou, ale snadnou". Vyžaduje méně vybavení, je jednodušší, ale je také méně účinná a povede k nižším výtěžkům.
Postup:
Do 500 ml sterilního 0,1M citrátového pufru o pH 6 přidejte 44 g kvasinek a 55 g glukózy. Umístěte do vodní lázně zahřáté na 30 °C. Inkubujte 40/50 minut.
Přidejte benzaldehyd (25 mmol) v 5 ml ethanolu a acetaldehyd (25 mmol). Inkubujte 60 minut.
Přefiltrujte přes celit.
Extrahujte 3*100 ml ethylacetátu. Emulze se rozbije nasyceným roztokem chloridu sodného, vysuší se nad bezvodým síranem sodným, zfiltruje se, rozpouštědlo se odpaří. Toto je váš L-PAC.
Vysvětlivky:
Citrátový pufr: používá se k udržení stabilního pH, protože růst buňky ho přes čas snižuje (což není dobré). Pro přípravu tohoto pufru postupujte podle postupů uvedených v této kalkulačce: https://www.aatbio.com/resources/buffer-preparations-and-recipes/citrate-buffer-ph-3-to-6-2. Nezapomeňte změnit pH na 6.
Teplota: umožňuje vyšší metabolickou aktivitu kvasinek.
Ethanol: používá se k rozpuštění benzaldehydu a acetaldehydu a zvyšuje jejich biologickou dostupnost.
Acetaldehyd: používá se jako akceptor vodíku místo benzaldehydu, čímž se omezuje produkce benzylalkoholu.
Jedná se o snadný postup, který může po troše čtení o standardních sterilních technikách provádět téměř každý, ale dává nižší výtěžky než druhý postup (mezi 20 a 40 %). Lze jej zlepšit buď lepším provzdušňováním pomocí orbitálního třepání při 150 otáčkách za minutu nebo pumpováním sterilního vzduchu do média, a to 1 litrem vzduchu na litr média za minutu, nebo imobilizací buněk v alginátových kuličkách. Můžete si to najít na youtube, je to velmi snadné a může to výrazně zvýšit výtěžnost.
Druhá metoda:
Tento protokol je pokročilejší, ale při správném postupu může zvýšit výtěžnost až o 60 nebo 70 %. Bude však vyžadovat více materiálu. I když není dokonalý, je mnohem lepší.
Tato metoda byla navržena pro kvasinky Candida utilis místo S. cerevisiae. Místo ní můžete použít SC, ale dojde ke snížení výtěžku. Kvasinku C. utilis můžete zakoupit zde: https://www.biomall.in/product/candida-utilis-atcc-9950-0779p-0779p.
Postup
Růstové médium se skládá z 10 g/l močoviny (přináší dusík), 10 g/l MgSO4 (přináší hořčík a síru) a 50 až 70 g/l cukru pomocí melasy. Rozpusťte v přiměřeném objemu 0,1M citrátového pufru o pH 6.
Den předem naočkujte výchozí kulturu kvasinek a inkubujte přes noc při 30 °C.
Odečtěte optickou hustotu (absorbanci) při 595 nm. Naočkujte fermentační reaktor 15% v/v výchozí kultury upravenou na OD 0,4. Příklad: Chcete-li naočkovat nádobu o objemu 1 l, pokud byla naměřena OD 0,2, přidejte 300 ml na 700 ml. Pokud je OD již 0,4, přidejte 150 ml na 850 ml atd... (240x106 buněk/ml v inokulaci, viz vysvětlivky).
Inkubujte při teplotě 30 °C s orbitálním třepáním při 150 otáčkách za minutu nebo s čerpáním sterilního vzduchu rychlostí 1 v/v/min. Pokud čerpáte vzduch, možná budete chtít přidat pomalé míchání.
Inkubujte, dokud OD nedosáhne hodnoty 0,3 až 0,4. To by mělo trvat 4 až 6 hodin, může to být méně nebo více. Každých 30 minut kontrolujte OD, dokud nedosáhnete požadované hodnoty.
Přídavek benzaldehydu se provádí v několika dávkách. Pro 50 ml jsou to objemy 68, 62, 56, 50, 43, 37, 31, 25. Současně přidejte ekvivalentní objem acetaldehydu. Mezi jednotlivými přídavky počkejte jednu hodinu.
Extrahujte za použití poměru 1:2 toluen/medium v/v, odpařte.
Vysvětlení:
Optická hustota: měří se pomocí spektrofotometru. Zde odečítáme absorbanci při 595 nm, která je úměrná počtu buněk v roztoku. Jako pravidlo si pamatujte, že 0,1 OD=60x10^6 buněk/ml.
Obecné poznámky:
Pro provzdušnění je v malém měřítku lepší orbitální třepání při 150 otáčkách za minutu. Ve větším měřítku budete potřebovat bublinkový vzduch procházející filtrem.
Ve druhém protokolu se přidání benzaldehydu provádí v několika dávkách, aby se zvýšily výtěžky. To lze dále zlepšit průběžným vstřikováním benzaldehydu v klesajícím poměru, ale to je v amatérském prostředí složité.
Lze použít substituované benzaldehydy a získat odpovídající analog L-PAC.
Nakonec si můžete vypůjčit některé prvky metody 2 a začlenit je do metody 1, abyste si přizpůsobili experimentální plán podle svých představ. Uvědomte si, že lze použít i jiné kmeny a druhy, což výrazně zvýší výtěžky. Další informace naleznete v článku "Production of L-phenyl Acetyl Carbinol (L-PAC) by different novel strains of yeasts in melasses and sugar cane juice as production medium" od Raviho a kol.
