Einführung
L-Phenylacetylcarbinol ist eine Verbindung, die bei der Synthese von Ephedrin verwendet wird, das wiederum als Vorstufe zu Amphetaminen dient. Industriell wird es durch aerobe Fermentation von Benzaldehyd durch Bäckerhefe (S. cerevisiae/SC) synthetisiert. Das Verfahren ist zwar recht einfach, erfordert aber einiges an Ausrüstung und Wissen, insbesondere wenn es um die Aufrechterhaltung steriler Kulturen und geeigneter Wachstumsbedingungen geht. Ich werde daher zwei unterschiedlich anspruchsvolle Methoden für die Herstellung von L-PAC durch Biotransformation erläutern. Das Wachstumsmedium sollte vor der Verwendung durch Autoklavieren sterilisiert werden.
Erste Methode:
Man könnte diese Technik als "schlampig, aber einfach" bezeichnen. Sie erfordert weniger Ausrüstung, ist einfacher, aber auch weniger effektiv und führt zu einer geringeren Ausbeute.
Verfahren:
In 500 ml sterilem 0,1 M pH-6-Citratpuffer 44 g Hefe und 55 g Glukose hinzufügen. In ein auf 30°C erhitztes Wasserbad stellen. 40/50 Minuten lang inkubieren.
Benzaldehyd (25 mmol) in 5 mL Ethanol und Acetaldehyd (25 mmol) zugeben. 60 Minuten lang inkubieren.
Durch Celite filtern.
Mit 3*100 ml Ethylacetat extrahieren. Emulsion mit gesättigter Natriumchloridlösung spalten, über wasserfreiem Natriumsulfat trocknen, filtrieren, Lösungsmittel abdampfen. Dies ist Ihr L-PAC.
Erklärungen:
Citratpuffer: Dieser Puffer wird verwendet, um den pH-Wert stabil zu halten, da er durch das Wachstum der Zelle mit der Zeit sinkt (was nicht gut ist). Um diesen Puffer herzustellen, folgen Sie den Anweisungen dieses Rechners: https://www.aatbio.com/resources/buffer-preparations-and-recipes/citrate-buffer-ph-3-to-6-2. Vergessen Sie nicht, den pH-Wert auf 6 zu ändern.
Temperatur: ermöglicht eine höhere Stoffwechselaktivität der Hefe.
Ethanol: wird zur Auflösung von Benzaldehyd und Acetaldehyd verwendet und erhöht deren Bioverfügbarkeit.
Acetaldehyd: wird als Wasserstoffakzeptor anstelle von Benzaldehyd verwendet, wodurch die Produktion von Benzylalkohol begrenzt wird.
Es handelt sich um ein einfaches Verfahren, das nach ein wenig Lektüre über sterile Standardtechniken von fast jedem angewandt werden kann, aber die Ausbeute ist geringer als bei den anderen Verfahren (zwischen 20 und 40 %). Die Ausbeute kann entweder durch eine bessere Belüftung verbessert werden, entweder durch orbitales Schütteln bei 150 U/min oder durch Einpumpen von steriler Luft in das Medium (1 l Luft pro Liter Medium pro Minute), oder durch Immobilisierung der Zellen in Alginatkügelchen. Sie können sich das auf Youtube ansehen, es ist sehr einfach und kann die Ausbeute erheblich steigern.
Zweite Methode:
Dieses Protokoll ist fortgeschrittener, kann aber die Ausbeute um bis zu 60 oder 70 % erhöhen, wenn es richtig gemacht wird. Es wird jedoch mehr Material benötigt. Auch wenn es nicht perfekt ist, ist es doch viel besser.
Diese Methode wurde für die Hefe Candida utilis anstelle von S. cerevisiae entwickelt. Sie können stattdessen auch SC verwenden, aber Sie werden einen geringeren Ertrag erzielen. Sie können C. utilis hier kaufen: https://www.biomall.in/product/candida-utilis-atcc-9950-0779p-0779p
Verfahren
Das Wachstumsmedium besteht aus 10g/L Harnstoff (bringt Stickstoff), 10g/L MgSO4 (bringt Magnesium und Schwefel) und zwischen 50 und 70g/L Zucker aus Melasse. Lösen Sie den Zucker in einer ausreichenden Menge von 0,1M pH 6 Citratpuffer auf.
Am Vortag eine Startkultur von Hefe beimpfen und über Nacht bei 30°C bebrüten.
Messen Sie die optische Dichte (Absorption) bei 595nm. Beimpfen Sie Ihren Fermentationsreaktor mit 15% v/v Ihrer auf 0,4 OD eingestellten Ausgangskultur. Beispiel: Um einen 1-Liter-Behälter zu beimpfen, wenn die OD bei 0,2 gemessen wurde, fügen Sie 300 ml zu 700 ml hinzu. Wenn die OD bereits 0,4 beträgt, fügen Sie 150 ml zu 850 ml hinzu usw. (240x106 Zellen/ml im Inokulum, siehe Erläuterungen).
Inkubieren Sie bei 30°C, entweder durch orbitales Schütteln bei 150 U/min oder durch Pumpen von steriler Luft mit einer Geschwindigkeit von 1 v/v/min. Wenn Sie Luft pumpen, sollten Sie etwas langsames Rühren dazuschalten.
Inkubieren, bis die OD zwischen 0,3 und 0,4 liegt. Dies sollte zwischen 4 und 6 Stunden dauern, kann aber auch weniger oder mehr sein. Überprüfen Sie die OD alle 30 Minuten, bis Sie den gewünschten Wert erreicht haben.
Die Zugabe von Benzaldehyd erfolgt in mehreren Dosen. Bei 50 ml sind das die Volumina 68, 62, 56, 50, 43, 37, 31, 25. Gleichzeitig wird eine entsprechende Menge Acetaldehyd zugegeben. Zwischen den einzelnen Zugaben eine Stunde warten.
Extrahieren mit 1:2 Toluol/Medium v/v, eindampfen.
Erläuterung:
Optische Dichte: Sie wird mit einem Spektrophotometer gemessen. Hier wird die Absorption bei 595nm gemessen, die proportional zur Anzahl der Zellen in der Lösung ist. Als Faustregel gilt: 0,1 OD=60x10^6 Zellen/mL
Allgemeine Hinweise:
Für die Belüftung ist in kleinem Maßstab orbitales Schütteln bei 150 U/min besser geeignet. In größerem Maßstab müssen Sie die Luft durch einen Filter blasen.
Im zweiten Protokoll wird die Zugabe von Benzaldehyd in mehreren Dosen vorgenommen, um die Ausbeute zu erhöhen. Die Ausbeute kann durch kontinuierliche Injektion von Benzaldehyd in abnehmender Menge weiter verbessert werden, was jedoch im Amateurbereich nur schwer zu bewerkstelligen ist.
Substituierte Benzaldehyde können verwendet werden und ergeben das entsprechende L-PAC-Analogon.
Schließlich können Sie einige Elemente von Methode 2 übernehmen und in Methode 1 einbauen, um den Versuchsplan nach Ihren Wünschen zu gestalten. Beachten Sie, dass auch andere Stämme und Spezies verwendet werden können, was die Ausbeute erheblich steigert. Weitere Informationen finden Sie unter "production of L-phenyl Acetyl Carbinol (L-PAC) by different novel strains of yeasts in molasses and sugar cane juice as production medium" von Ravi et al.
L-Phenylacetylcarbinol ist eine Verbindung, die bei der Synthese von Ephedrin verwendet wird, das wiederum als Vorstufe zu Amphetaminen dient. Industriell wird es durch aerobe Fermentation von Benzaldehyd durch Bäckerhefe (S. cerevisiae/SC) synthetisiert. Das Verfahren ist zwar recht einfach, erfordert aber einiges an Ausrüstung und Wissen, insbesondere wenn es um die Aufrechterhaltung steriler Kulturen und geeigneter Wachstumsbedingungen geht. Ich werde daher zwei unterschiedlich anspruchsvolle Methoden für die Herstellung von L-PAC durch Biotransformation erläutern. Das Wachstumsmedium sollte vor der Verwendung durch Autoklavieren sterilisiert werden.
Erste Methode:
Man könnte diese Technik als "schlampig, aber einfach" bezeichnen. Sie erfordert weniger Ausrüstung, ist einfacher, aber auch weniger effektiv und führt zu einer geringeren Ausbeute.
Verfahren:
In 500 ml sterilem 0,1 M pH-6-Citratpuffer 44 g Hefe und 55 g Glukose hinzufügen. In ein auf 30°C erhitztes Wasserbad stellen. 40/50 Minuten lang inkubieren.
Benzaldehyd (25 mmol) in 5 mL Ethanol und Acetaldehyd (25 mmol) zugeben. 60 Minuten lang inkubieren.
Durch Celite filtern.
Mit 3*100 ml Ethylacetat extrahieren. Emulsion mit gesättigter Natriumchloridlösung spalten, über wasserfreiem Natriumsulfat trocknen, filtrieren, Lösungsmittel abdampfen. Dies ist Ihr L-PAC.
Erklärungen:
Citratpuffer: Dieser Puffer wird verwendet, um den pH-Wert stabil zu halten, da er durch das Wachstum der Zelle mit der Zeit sinkt (was nicht gut ist). Um diesen Puffer herzustellen, folgen Sie den Anweisungen dieses Rechners: https://www.aatbio.com/resources/buffer-preparations-and-recipes/citrate-buffer-ph-3-to-6-2. Vergessen Sie nicht, den pH-Wert auf 6 zu ändern.
Temperatur: ermöglicht eine höhere Stoffwechselaktivität der Hefe.
Ethanol: wird zur Auflösung von Benzaldehyd und Acetaldehyd verwendet und erhöht deren Bioverfügbarkeit.
Acetaldehyd: wird als Wasserstoffakzeptor anstelle von Benzaldehyd verwendet, wodurch die Produktion von Benzylalkohol begrenzt wird.
Es handelt sich um ein einfaches Verfahren, das nach ein wenig Lektüre über sterile Standardtechniken von fast jedem angewandt werden kann, aber die Ausbeute ist geringer als bei den anderen Verfahren (zwischen 20 und 40 %). Die Ausbeute kann entweder durch eine bessere Belüftung verbessert werden, entweder durch orbitales Schütteln bei 150 U/min oder durch Einpumpen von steriler Luft in das Medium (1 l Luft pro Liter Medium pro Minute), oder durch Immobilisierung der Zellen in Alginatkügelchen. Sie können sich das auf Youtube ansehen, es ist sehr einfach und kann die Ausbeute erheblich steigern.
Zweite Methode:
Dieses Protokoll ist fortgeschrittener, kann aber die Ausbeute um bis zu 60 oder 70 % erhöhen, wenn es richtig gemacht wird. Es wird jedoch mehr Material benötigt. Auch wenn es nicht perfekt ist, ist es doch viel besser.
Diese Methode wurde für die Hefe Candida utilis anstelle von S. cerevisiae entwickelt. Sie können stattdessen auch SC verwenden, aber Sie werden einen geringeren Ertrag erzielen. Sie können C. utilis hier kaufen: https://www.biomall.in/product/candida-utilis-atcc-9950-0779p-0779p
Verfahren
Das Wachstumsmedium besteht aus 10g/L Harnstoff (bringt Stickstoff), 10g/L MgSO4 (bringt Magnesium und Schwefel) und zwischen 50 und 70g/L Zucker aus Melasse. Lösen Sie den Zucker in einer ausreichenden Menge von 0,1M pH 6 Citratpuffer auf.
Am Vortag eine Startkultur von Hefe beimpfen und über Nacht bei 30°C bebrüten.
Messen Sie die optische Dichte (Absorption) bei 595nm. Beimpfen Sie Ihren Fermentationsreaktor mit 15% v/v Ihrer auf 0,4 OD eingestellten Ausgangskultur. Beispiel: Um einen 1-Liter-Behälter zu beimpfen, wenn die OD bei 0,2 gemessen wurde, fügen Sie 300 ml zu 700 ml hinzu. Wenn die OD bereits 0,4 beträgt, fügen Sie 150 ml zu 850 ml hinzu usw. (240x106 Zellen/ml im Inokulum, siehe Erläuterungen).
Inkubieren Sie bei 30°C, entweder durch orbitales Schütteln bei 150 U/min oder durch Pumpen von steriler Luft mit einer Geschwindigkeit von 1 v/v/min. Wenn Sie Luft pumpen, sollten Sie etwas langsames Rühren dazuschalten.
Inkubieren, bis die OD zwischen 0,3 und 0,4 liegt. Dies sollte zwischen 4 und 6 Stunden dauern, kann aber auch weniger oder mehr sein. Überprüfen Sie die OD alle 30 Minuten, bis Sie den gewünschten Wert erreicht haben.
Die Zugabe von Benzaldehyd erfolgt in mehreren Dosen. Bei 50 ml sind das die Volumina 68, 62, 56, 50, 43, 37, 31, 25. Gleichzeitig wird eine entsprechende Menge Acetaldehyd zugegeben. Zwischen den einzelnen Zugaben eine Stunde warten.
Extrahieren mit 1:2 Toluol/Medium v/v, eindampfen.
Erläuterung:
Optische Dichte: Sie wird mit einem Spektrophotometer gemessen. Hier wird die Absorption bei 595nm gemessen, die proportional zur Anzahl der Zellen in der Lösung ist. Als Faustregel gilt: 0,1 OD=60x10^6 Zellen/mL
Allgemeine Hinweise:
Für die Belüftung ist in kleinem Maßstab orbitales Schütteln bei 150 U/min besser geeignet. In größerem Maßstab müssen Sie die Luft durch einen Filter blasen.
Im zweiten Protokoll wird die Zugabe von Benzaldehyd in mehreren Dosen vorgenommen, um die Ausbeute zu erhöhen. Die Ausbeute kann durch kontinuierliche Injektion von Benzaldehyd in abnehmender Menge weiter verbessert werden, was jedoch im Amateurbereich nur schwer zu bewerkstelligen ist.
Substituierte Benzaldehyde können verwendet werden und ergeben das entsprechende L-PAC-Analogon.
Schließlich können Sie einige Elemente von Methode 2 übernehmen und in Methode 1 einbauen, um den Versuchsplan nach Ihren Wünschen zu gestalten. Beachten Sie, dass auch andere Stämme und Spezies verwendet werden können, was die Ausbeute erheblich steigert. Weitere Informationen finden Sie unter "production of L-phenyl Acetyl Carbinol (L-PAC) by different novel strains of yeasts in molasses and sugar cane juice as production medium" von Ravi et al.
