Sissejuhatus
L-fenüülatsetüülkarbinool on ühend, mida kasutatakse efedriini sünteesimisel, mida omakorda kasutatakse amfetamiinide lähteainena. Tööstuslikult sünteesitakse seda bensaldehüüdi aeroobse kääritamise teel pagaripärmi (S. cerevisiae/SC) abil. Kuigi protsess on üsna lihtne, võib see nõuda mõningaid seadmeid ja teadmisi, eriti kui rääkida steriilsete kultuuride ja nõuetekohaste kasvutingimuste säilitamisest. Seepärast selgitan kahte erineva keerukusega meetodit L-PACi tootmiseks biotransformatsiooni teel. Kasvukeskkond tuleks enne kasutamist steriliseerida autoklaaviga.
Esimene meetod:
Seda meetodit võiks kirjeldada kui "lohakas, kuid lihtne". See nõuab vähem seadmeid, on lihtsam, kuid on ka vähem tõhus ja annab väiksema saagise.
Menetlus:
500 ml steriilsesse 0,1M pH 6 tsitraadipuhvrisse lisatakse 44 g pärmi ja 55 g glükoosi. Asetage 30 °C juures kuumutatud vesivanni. Inkubeeritakse 40/50 minutit.
Lisatakse bensaldehüüdi (25 mmol) 5 ml etanoolis ja atseetaldehüüdi (25 mmol). Inkubeeritakse 60 minutit.
Filtreeritakse läbi tseliidi.
Ekstraheeritakse 3*100 ml etüülatsetaadiga. Emulsioon purustatakse küllastunud naatriumkloriidi lahusega, kuivatatakse veevaba naatriumsulfaadi kohal, filtreeritakse, aurustatakse lahusti. See on teie L-PAC.
Selgitused:
Tsitraadipuhver: seda kasutatakse stabiilse pH taseme säilitamiseks, kuna raku kasv alandab seda aja jooksul (ei ole hea). Selle puhvri valmistamiseks järgige selles kalkulaatoris toodud protseduure: https://www.aatbio.com/resources/buffer-preparations-and-recipes/citrate-buffer-ph-3-to-6-2. Ärge unustage muuta pH väärtuseks 6.
Temperatuur: võimaldab pärmi suuremat ainevahetuse aktiivsust.
Etanool: kasutatakse bensaldehüüdi ja atseetaldehüüdi lahustamiseks ja suurendab nende biosaadavust.
Atseetaldehüüd: kasutatakse bensaldehüüdi asemel vesinikaktseptorina, mis piirab bensüülalkoholi tootmist.
See on lihtne menetlus, mida peaaegu igaüks saab järgida pärast mõningast lugemist standardsetest steriilsetest tehnikatest, kuid annab väiksema saagise kui teine menetlus (vahemikus 20-40%). Seda saab parandada kas parema õhutamisega, kasutades kas orbitaalset raputamist 150 rpm juures või pumbates steriilset õhku söötmesse, 1L õhku ühe liitri söötme kohta minutis, või immobiliseerides rakud alginaathelmestesse. Võite seda youtube'ist otsida, seda on väga lihtne teha ja see võib saagikust märkimisväärselt suurendada.
Teine meetod:
See protokoll on keerulisem, kuid võib suurendada saagist kuni 60 või 70%, kui seda õigesti teha. See nõuab aga rohkem materjali. Kuigi see ei ole täiuslik, on see palju parem.
See meetod on mõeldud S. cerevisiae asemel pärmile Candida utilis. Selle asemel võib kasutada SC-d, kuid saagikus väheneb. C. utilis't saab osta siit: https://www.biomall.in/product/candida-utilis-atcc-9950-0779p-0779p.
Menetlus
Kasvukeskkond koosneb 10g/L karbamiidist (toob lämmastikku), 10g/L MgSO4 (toob magneesiumi ja väävlit) ja 50-70g/L suhkrust, kasutades melassi. Lahustatakse piisavas koguses 0,1M pH 6 tsitraadipuhvris.
Eelmisel päeval inokuleerige pärmi algkultuur ja inkubeerige 30 °C juures üleöö.
Mõõtke optilist tihedust (neelduvust) 595 nm juures. Inokuleerige oma fermentatsioonireaktorit 15% v/v algkultuuriga, mis on reguleeritud OD-ni 0,4. Näide: 1L mahuti inokuleerimiseks, kui OD on mõõdetud 0,2, lisage 300mL kuni 700mL. Kui OD on juba 0,4, lisage 150mL 850mL-le jne... (240x106 rakku/ml inokulumis, vt selgitusi).
Inkubeerige 30 °C juures, raputades orbitaalselt 150 rpm või pumbates steriilset õhku kiirusega 1 v/v/min. Õhu pumpamise korral võiksite lisada aeglase segamise.
Inkubeerige, kuni OD saavutab 0,3-0,4. See peaks kestma 4-6 tundi, võib olla vähem või rohkem. Kontrollige OD iga 30 minuti järel, kuni saavutate soovitud väärtuse.
Bensaldehüüdi lisamine toimub mitmes annuses. 50mL puhul on mahud 68, 62, 56, 50, 43, 37, 31, 25. Lisage samal ajal samaväärne kogus atseetaldehüüdi. Oodake iga lisamise vahel üks tund.
Ekstraheeritakse, kasutades 1:2 tolueeni/medium v/v, aurustatakse.
Selgitus:
Optiline tihedus: seda mõõdetakse spektrofotomeetriga. Siin loeme neeldumist 595 nm juures, mis on proportsionaalne rakkude arvuga lahuses. Rusikareeglina tuleb meeles pidada, et 0,1 OD=60x10^6 rakku/ml.
Üldised märkused:
Õhustamise jaoks on väikeses ulatuses parem orbitaalne raputamine 150 rpm juures. Suuremates mõõtkavades on vaja läbi filtri läbitud mulliõhku.
Teises protokollis tehakse bensaldehüüdi lisamine mitmes annuses, et suurendada saagist. Seda saab veelgi parandada, süstides bensaldehüüdi pidevalt väheneva kiirusega, kuid seda on amatööride puhul keeruline teha.
Asendatud bensaldehüüde võib kasutada ja need annavad vastava L-PAC analoogi.
Lõpuks võite laenata mõne elemendi meetodist 2 ja lisada need meetodisse 1, et kohandada katsekorraldust oma maitse järgi. Olge teadlik, et võib kasutada ka teisi tüvesid ja liike, mis suurendab oluliselt saagist. Lisateavet vt "L-fenüülatsetüülkarbinooli (L-PAC) tootmine erinevate uudsete pärmitüvede tüvedega melassi ja suhkruroomahla kui tootmissubstraadi abil" (Ravi et al).
L-fenüülatsetüülkarbinool on ühend, mida kasutatakse efedriini sünteesimisel, mida omakorda kasutatakse amfetamiinide lähteainena. Tööstuslikult sünteesitakse seda bensaldehüüdi aeroobse kääritamise teel pagaripärmi (S. cerevisiae/SC) abil. Kuigi protsess on üsna lihtne, võib see nõuda mõningaid seadmeid ja teadmisi, eriti kui rääkida steriilsete kultuuride ja nõuetekohaste kasvutingimuste säilitamisest. Seepärast selgitan kahte erineva keerukusega meetodit L-PACi tootmiseks biotransformatsiooni teel. Kasvukeskkond tuleks enne kasutamist steriliseerida autoklaaviga.
Esimene meetod:
Seda meetodit võiks kirjeldada kui "lohakas, kuid lihtne". See nõuab vähem seadmeid, on lihtsam, kuid on ka vähem tõhus ja annab väiksema saagise.
Menetlus:
500 ml steriilsesse 0,1M pH 6 tsitraadipuhvrisse lisatakse 44 g pärmi ja 55 g glükoosi. Asetage 30 °C juures kuumutatud vesivanni. Inkubeeritakse 40/50 minutit.
Lisatakse bensaldehüüdi (25 mmol) 5 ml etanoolis ja atseetaldehüüdi (25 mmol). Inkubeeritakse 60 minutit.
Filtreeritakse läbi tseliidi.
Ekstraheeritakse 3*100 ml etüülatsetaadiga. Emulsioon purustatakse küllastunud naatriumkloriidi lahusega, kuivatatakse veevaba naatriumsulfaadi kohal, filtreeritakse, aurustatakse lahusti. See on teie L-PAC.
Selgitused:
Tsitraadipuhver: seda kasutatakse stabiilse pH taseme säilitamiseks, kuna raku kasv alandab seda aja jooksul (ei ole hea). Selle puhvri valmistamiseks järgige selles kalkulaatoris toodud protseduure: https://www.aatbio.com/resources/buffer-preparations-and-recipes/citrate-buffer-ph-3-to-6-2. Ärge unustage muuta pH väärtuseks 6.
Temperatuur: võimaldab pärmi suuremat ainevahetuse aktiivsust.
Etanool: kasutatakse bensaldehüüdi ja atseetaldehüüdi lahustamiseks ja suurendab nende biosaadavust.
Atseetaldehüüd: kasutatakse bensaldehüüdi asemel vesinikaktseptorina, mis piirab bensüülalkoholi tootmist.
See on lihtne menetlus, mida peaaegu igaüks saab järgida pärast mõningast lugemist standardsetest steriilsetest tehnikatest, kuid annab väiksema saagise kui teine menetlus (vahemikus 20-40%). Seda saab parandada kas parema õhutamisega, kasutades kas orbitaalset raputamist 150 rpm juures või pumbates steriilset õhku söötmesse, 1L õhku ühe liitri söötme kohta minutis, või immobiliseerides rakud alginaathelmestesse. Võite seda youtube'ist otsida, seda on väga lihtne teha ja see võib saagikust märkimisväärselt suurendada.
Teine meetod:
See protokoll on keerulisem, kuid võib suurendada saagist kuni 60 või 70%, kui seda õigesti teha. See nõuab aga rohkem materjali. Kuigi see ei ole täiuslik, on see palju parem.
See meetod on mõeldud S. cerevisiae asemel pärmile Candida utilis. Selle asemel võib kasutada SC-d, kuid saagikus väheneb. C. utilis't saab osta siit: https://www.biomall.in/product/candida-utilis-atcc-9950-0779p-0779p.
Menetlus
Kasvukeskkond koosneb 10g/L karbamiidist (toob lämmastikku), 10g/L MgSO4 (toob magneesiumi ja väävlit) ja 50-70g/L suhkrust, kasutades melassi. Lahustatakse piisavas koguses 0,1M pH 6 tsitraadipuhvris.
Eelmisel päeval inokuleerige pärmi algkultuur ja inkubeerige 30 °C juures üleöö.
Mõõtke optilist tihedust (neelduvust) 595 nm juures. Inokuleerige oma fermentatsioonireaktorit 15% v/v algkultuuriga, mis on reguleeritud OD-ni 0,4. Näide: 1L mahuti inokuleerimiseks, kui OD on mõõdetud 0,2, lisage 300mL kuni 700mL. Kui OD on juba 0,4, lisage 150mL 850mL-le jne... (240x106 rakku/ml inokulumis, vt selgitusi).
Inkubeerige 30 °C juures, raputades orbitaalselt 150 rpm või pumbates steriilset õhku kiirusega 1 v/v/min. Õhu pumpamise korral võiksite lisada aeglase segamise.
Inkubeerige, kuni OD saavutab 0,3-0,4. See peaks kestma 4-6 tundi, võib olla vähem või rohkem. Kontrollige OD iga 30 minuti järel, kuni saavutate soovitud väärtuse.
Bensaldehüüdi lisamine toimub mitmes annuses. 50mL puhul on mahud 68, 62, 56, 50, 43, 37, 31, 25. Lisage samal ajal samaväärne kogus atseetaldehüüdi. Oodake iga lisamise vahel üks tund.
Ekstraheeritakse, kasutades 1:2 tolueeni/medium v/v, aurustatakse.
Selgitus:
Optiline tihedus: seda mõõdetakse spektrofotomeetriga. Siin loeme neeldumist 595 nm juures, mis on proportsionaalne rakkude arvuga lahuses. Rusikareeglina tuleb meeles pidada, et 0,1 OD=60x10^6 rakku/ml.
Üldised märkused:
Õhustamise jaoks on väikeses ulatuses parem orbitaalne raputamine 150 rpm juures. Suuremates mõõtkavades on vaja läbi filtri läbitud mulliõhku.
Teises protokollis tehakse bensaldehüüdi lisamine mitmes annuses, et suurendada saagist. Seda saab veelgi parandada, süstides bensaldehüüdi pidevalt väheneva kiirusega, kuid seda on amatööride puhul keeruline teha.
Asendatud bensaldehüüde võib kasutada ja need annavad vastava L-PAC analoogi.
Lõpuks võite laenata mõne elemendi meetodist 2 ja lisada need meetodisse 1, et kohandada katsekorraldust oma maitse järgi. Olge teadlik, et võib kasutada ka teisi tüvesid ja liike, mis suurendab oluliselt saagist. Lisateavet vt "L-fenüülatsetüülkarbinooli (L-PAC) tootmine erinevate uudsete pärmitüvede tüvedega melassi ja suhkruroomahla kui tootmissubstraadi abil" (Ravi et al).
