Johdanto
L-fenyyliasetyylikarbinoli on yhdiste, jota käytetään efedriinin synteesissä, jota itse käytetään amfetamiinien esiasteena. Teollisesti se syntetisoidaan leivontahiivassa (S. cerevisiae/SC) bentsaldehydin aerobisen käymisen avulla. Vaikka prosessi on melko yksinkertainen, se voi vaatia jonkin verran laitteita ja tietoa, erityisesti kun puhutaan steriilien viljelmien ja asianmukaisten kasvuolosuhteiden ylläpitämisestä. Siksi selitän kaksi erilaista menetelmää L-PAC:n tuottamiseksi biotransformaation avulla. Kasvualusta on steriloitava autoklavoimalla ennen käyttöä.
Ensimmäinen menetelmä:
Tätä menetelmää voisi kuvailla "huolimattomaksi mutta helpoksi". Se vaatii vähemmän laitteita, on helpompi, mutta on myös tehottomampi ja johtaa pienempiin saantoihin.
Menettely:
Lisätään 500 ml:aan steriiliä 0,1 M pH 6 -sitraattipuskuria 44 g hiivaa ja 55 g glukoosia. Laitetaan vesihauteeseen, jota lämmitetään 30 °C:ssa. Inkuboidaan 40/50 minuuttia.
Lisätään bentsaldehydiä (25 mmol) 5 ml:aan etanolia ja asetaldehydiä (25 mmol). Inkuboidaan 60 minuuttia.
Suodatetaan Celiten läpi.
Uutetaan 3*100 ml:lla etyyliasetaattia. Rikotaan emulsio käyttäen kyllästettyä natriumkloridiliuosta, kuivataan vedettömän natriumsulfaatin päällä, suodatetaan, haihdutetaan liuotin. Tämä on L-PAC.
Selitykset:
Sitraattipuskuri: tätä käytetään pH:n pitämiseen vakaana, koska solun kasvu laskee sitä ylitöiden aikana (ei hyvä). Tämän puskurin valmistamiseksi noudata tämän laskurin antamia ohjeita: https://www.aatbio.com/resources/buffer-preparations-and-recipes/citrate-buffer-ph-3-to-6-2. Älä unohda muuttaa pH-arvoa 6:een.
Lämpötila: mahdollistaa hiivan suuremman metabolisen aktiivisuuden.
Etanoli: käytetään bentsaldehydin ja asetaldehydin liuottamiseen ja lisää niiden biosaatavuutta.
Asetaldehydi: käytetään vetyakseptorina bentsaldehydin sijasta, mikä rajoittaa bentsyylialkoholin tuotantoa.
Tämä on helppo menettely, jota lähes kuka tahansa voi noudattaa luettuaan hieman steriilejä standarditekniikoita, mutta sen saanto on alhaisempi kuin toisen menetelmän (20-40 %). Menetelmää voidaan parantaa joko parantamalla ilmastusta joko ravistamalla 150 rpm:n kierrosluvulla tai pumppaamalla steriiliä ilmaa väliaineeseen, 1 l ilmaa litraa väliaineen litraa kohti minuutissa, tai immobilisoimalla solut alginaattihelmiin. Voit katsoa tätä youtubesta, se on erittäin helppo tehdä ja voi lisätä saantoja merkittävästi.
Toinen menetelmä:
Tämä protokolla on edistyneempi, mutta se voi lisätä saantoja jopa 60 tai 70 %, jos se tehdään oikein. Se vaatii kuitenkin enemmän materiaalia. Vaikka se ei olekaan täydellinen, se on paljon parempi.
Tämä menetelmä on suunniteltu S. cerevisiae -hiivalle Candida utilis -hiivalle S. cerevisiaen sijaan. Voit käyttää sen sijaan SC:tä, mutta saanto laskee. Voit ostaa C. utilis -hiivaa täältä: https://www.biomall.in/product/candida-utilis-atcc-9950-0779p-0779p.
Menettely
Kasvualusta koostuu 10 g/l ureasta (tuo typpeä), 10 g/l MgSO4:stä (tuo magnesiumia ja rikkiä) ja 50-70 g/l sokeria melassia käyttäen. Liuotetaan riittävään tilavuuteen 0,1M pH 6 -sitraattipuskuria.
Edellisenä päivänä inokuloidaan hiivan aloitusviljelmä ja inkuboidaan 30 °C:ssa yön yli.
Luetaan optinen tiheys (absorbanssi) 595 nm:ssä. Inokuloi fermentointireaktori 15 % v/v lähtöviljelmästäsi, joka on säädetty 0,4 OD:hen. Esimerkki: jos 1 litran säiliön inokuloimiseksi OD mitattiin 0,2:ssa, lisää 300 ml 700 ml:aan. Jos OD on jo 0,4, lisää 150 ml 850 ml:aan jne... (240x106 solua/ml inokulaatiossa, ks. selitykset).
Inkuboidaan 30 °C:ssa joko ravistelemalla 150 rpm tai pumppaamalla steriiliä ilmaa nopeudella 1 v/v/min. Jos pumppaat ilmaa, saatat haluta lisätä siihen hidasta sekoittamista.
Inkuboidaan, kunnes OD on 0,3-0,4. Tämän pitäisi kestää 4-6 tuntia, voi olla vähemmän tai enemmän. Tarkista OD 30 minuutin välein, kunnes saavutat halutun arvon.
Bentsaldehydin lisääminen tehdään useina annoksina. 50 ml:n tilavuudet ovat 68, 62, 56, 50, 43, 37, 31, 25. Lisää samanaikaisesti vastaava määrä asetaldehydiä. Odota tunti jokaisen lisäyksen välillä.
Uutetaan käyttäen 1:2 tolueeni/medium v/v, haihdutetaan.
Selitys:
Optinen tiheys: mitataan spektrofotometrillä. Tässä luetaan absorbanssi 595 nm:ssä, joka on verrannollinen solujen määrään liuoksessa. Nyrkkisääntönä on muistettava, että 0,1 OD=60x10^6 solua/ml.
Yleisiä huomautuksia:
Pienessä mittakaavassa ilmastus on parempi, kun kiertorataa ravistetaan 150 rpm. Suuremmassa mittakaavassa on käytettävä suodattimen läpi johdettua kuplivaa ilmaa.
Toisessa protokollassa bentsaldehydin lisääminen tehdään useina annoksina saantojen lisäämiseksi. Tätä voidaan parantaa edelleen ruiskuttamalla bentsaldehydiä jatkuvasti vähenevällä nopeudella, mutta tämä on monimutkaista tehdä harrastelijoille.
Substituoituja bentsaldehydejä voidaan käyttää, ja niistä saadaan vastaava L-PAC-analogi.
Lopuksi voit lainata joitakin menetelmän 2 elementtejä ja sisällyttää ne menetelmään 1, jotta voit muokata koesuunnitelmaa mieleiseksesi. Huomaa, että muita kantoja ja lajeja voidaan käyttää, mikä lisää saantoja huomattavasti. Katso lisätietoja Ravi et al. artikkelista "production of L-phenyl Acetyl Carbinol (L-PAC) by different novel strains of yeasts in melasses and sugar cane juice as production medium".
L-fenyyliasetyylikarbinoli on yhdiste, jota käytetään efedriinin synteesissä, jota itse käytetään amfetamiinien esiasteena. Teollisesti se syntetisoidaan leivontahiivassa (S. cerevisiae/SC) bentsaldehydin aerobisen käymisen avulla. Vaikka prosessi on melko yksinkertainen, se voi vaatia jonkin verran laitteita ja tietoa, erityisesti kun puhutaan steriilien viljelmien ja asianmukaisten kasvuolosuhteiden ylläpitämisestä. Siksi selitän kaksi erilaista menetelmää L-PAC:n tuottamiseksi biotransformaation avulla. Kasvualusta on steriloitava autoklavoimalla ennen käyttöä.
Ensimmäinen menetelmä:
Tätä menetelmää voisi kuvailla "huolimattomaksi mutta helpoksi". Se vaatii vähemmän laitteita, on helpompi, mutta on myös tehottomampi ja johtaa pienempiin saantoihin.
Menettely:
Lisätään 500 ml:aan steriiliä 0,1 M pH 6 -sitraattipuskuria 44 g hiivaa ja 55 g glukoosia. Laitetaan vesihauteeseen, jota lämmitetään 30 °C:ssa. Inkuboidaan 40/50 minuuttia.
Lisätään bentsaldehydiä (25 mmol) 5 ml:aan etanolia ja asetaldehydiä (25 mmol). Inkuboidaan 60 minuuttia.
Suodatetaan Celiten läpi.
Uutetaan 3*100 ml:lla etyyliasetaattia. Rikotaan emulsio käyttäen kyllästettyä natriumkloridiliuosta, kuivataan vedettömän natriumsulfaatin päällä, suodatetaan, haihdutetaan liuotin. Tämä on L-PAC.
Selitykset:
Sitraattipuskuri: tätä käytetään pH:n pitämiseen vakaana, koska solun kasvu laskee sitä ylitöiden aikana (ei hyvä). Tämän puskurin valmistamiseksi noudata tämän laskurin antamia ohjeita: https://www.aatbio.com/resources/buffer-preparations-and-recipes/citrate-buffer-ph-3-to-6-2. Älä unohda muuttaa pH-arvoa 6:een.
Lämpötila: mahdollistaa hiivan suuremman metabolisen aktiivisuuden.
Etanoli: käytetään bentsaldehydin ja asetaldehydin liuottamiseen ja lisää niiden biosaatavuutta.
Asetaldehydi: käytetään vetyakseptorina bentsaldehydin sijasta, mikä rajoittaa bentsyylialkoholin tuotantoa.
Tämä on helppo menettely, jota lähes kuka tahansa voi noudattaa luettuaan hieman steriilejä standarditekniikoita, mutta sen saanto on alhaisempi kuin toisen menetelmän (20-40 %). Menetelmää voidaan parantaa joko parantamalla ilmastusta joko ravistamalla 150 rpm:n kierrosluvulla tai pumppaamalla steriiliä ilmaa väliaineeseen, 1 l ilmaa litraa väliaineen litraa kohti minuutissa, tai immobilisoimalla solut alginaattihelmiin. Voit katsoa tätä youtubesta, se on erittäin helppo tehdä ja voi lisätä saantoja merkittävästi.
Toinen menetelmä:
Tämä protokolla on edistyneempi, mutta se voi lisätä saantoja jopa 60 tai 70 %, jos se tehdään oikein. Se vaatii kuitenkin enemmän materiaalia. Vaikka se ei olekaan täydellinen, se on paljon parempi.
Tämä menetelmä on suunniteltu S. cerevisiae -hiivalle Candida utilis -hiivalle S. cerevisiaen sijaan. Voit käyttää sen sijaan SC:tä, mutta saanto laskee. Voit ostaa C. utilis -hiivaa täältä: https://www.biomall.in/product/candida-utilis-atcc-9950-0779p-0779p.
Menettely
Kasvualusta koostuu 10 g/l ureasta (tuo typpeä), 10 g/l MgSO4:stä (tuo magnesiumia ja rikkiä) ja 50-70 g/l sokeria melassia käyttäen. Liuotetaan riittävään tilavuuteen 0,1M pH 6 -sitraattipuskuria.
Edellisenä päivänä inokuloidaan hiivan aloitusviljelmä ja inkuboidaan 30 °C:ssa yön yli.
Luetaan optinen tiheys (absorbanssi) 595 nm:ssä. Inokuloi fermentointireaktori 15 % v/v lähtöviljelmästäsi, joka on säädetty 0,4 OD:hen. Esimerkki: jos 1 litran säiliön inokuloimiseksi OD mitattiin 0,2:ssa, lisää 300 ml 700 ml:aan. Jos OD on jo 0,4, lisää 150 ml 850 ml:aan jne... (240x106 solua/ml inokulaatiossa, ks. selitykset).
Inkuboidaan 30 °C:ssa joko ravistelemalla 150 rpm tai pumppaamalla steriiliä ilmaa nopeudella 1 v/v/min. Jos pumppaat ilmaa, saatat haluta lisätä siihen hidasta sekoittamista.
Inkuboidaan, kunnes OD on 0,3-0,4. Tämän pitäisi kestää 4-6 tuntia, voi olla vähemmän tai enemmän. Tarkista OD 30 minuutin välein, kunnes saavutat halutun arvon.
Bentsaldehydin lisääminen tehdään useina annoksina. 50 ml:n tilavuudet ovat 68, 62, 56, 50, 43, 37, 31, 25. Lisää samanaikaisesti vastaava määrä asetaldehydiä. Odota tunti jokaisen lisäyksen välillä.
Uutetaan käyttäen 1:2 tolueeni/medium v/v, haihdutetaan.
Selitys:
Optinen tiheys: mitataan spektrofotometrillä. Tässä luetaan absorbanssi 595 nm:ssä, joka on verrannollinen solujen määrään liuoksessa. Nyrkkisääntönä on muistettava, että 0,1 OD=60x10^6 solua/ml.
Yleisiä huomautuksia:
Pienessä mittakaavassa ilmastus on parempi, kun kiertorataa ravistetaan 150 rpm. Suuremmassa mittakaavassa on käytettävä suodattimen läpi johdettua kuplivaa ilmaa.
Toisessa protokollassa bentsaldehydin lisääminen tehdään useina annoksina saantojen lisäämiseksi. Tätä voidaan parantaa edelleen ruiskuttamalla bentsaldehydiä jatkuvasti vähenevällä nopeudella, mutta tämä on monimutkaista tehdä harrastelijoille.
Substituoituja bentsaldehydejä voidaan käyttää, ja niistä saadaan vastaava L-PAC-analogi.
Lopuksi voit lainata joitakin menetelmän 2 elementtejä ja sisällyttää ne menetelmään 1, jotta voit muokata koesuunnitelmaa mieleiseksesi. Huomaa, että muita kantoja ja lajeja voidaan käyttää, mikä lisää saantoja huomattavasti. Katso lisätietoja Ravi et al. artikkelista "production of L-phenyl Acetyl Carbinol (L-PAC) by different novel strains of yeasts in melasses and sugar cane juice as production medium".
