Introduzione
Il L-fenilacetilcarbinolo è un composto utilizzato nella sintesi dell'efedrina, a sua volta utilizzata come precursore delle anfetamine. A livello industriale, viene sintetizzato dalla fermentazione aerobica della benzaldeide da parte del lievito di panetteria (S. cerevisiae/SC). Sebbene il processo sia abbastanza semplice, può richiedere un po' di attrezzature e conoscenze, soprattutto per quanto riguarda il mantenimento di colture sterili e condizioni di crescita adeguate. Vi illustrerò quindi due metodi di diversa complessità per la produzione di L-PAC attraverso la biotrasformazione. Il terreno di coltura deve essere sterilizzato in autoclave prima dell'uso.
Primo metodo:
Si potrebbe descrivere questa tecnica come "sciatta ma facile". Richiede meno attrezzature, è più facile, ma è anche meno efficace e darà luogo a rese inferiori.
Procedura:
In 500 ml di tampone citrato sterile 0,1 M pH 6 aggiungere 44 g di lievito e 55 g di glucosio. Mettere in un bagno d'acqua riscaldato a 30°C. Incubare per 40/50 minuti.
Aggiungere benzaldeide (25 mmol) in 5 mL di etanolo e acetaldeide (25 mmol). Incubare per 60 minuti.
Filtrare su Celite.
Estrarre con 3*100 ml di acetato di etile. Rompere l'emulsione con una soluzione satura di cloruro di sodio, asciugare su solfato di sodio anidro, filtrare e far evaporare il solvente. Questo è il vostro L-PAC.
Spiegazioni:
Tampone citrato: viene utilizzato per mantenere un pH stabile, poiché la crescita della cellula lo abbasserà nel tempo (non va bene). Per preparare questo tampone, seguire le procedure indicate da questa calcolatrice: https://www.aatbio.com/resources/buffer-preparations-and-recipes/citrate-buffer-ph-3-to-6-2. Non dimenticate di portare il pH a 6.
Temperatura: consente una maggiore attività metabolica del lievito.
Etanolo: utilizzato per sciogliere la benzaldeide e l'acetaldeide e per aumentarne la biodisponibilità.
Acetaldeide: utilizzata come accettore di idrogeno al posto della benzaldeide, limitando così la produzione di alcol benzilico.
Si tratta di una procedura facile che quasi tutti possono seguire dopo un po' di letture sulle tecniche sterili standard, ma che dà rese inferiori rispetto all'altra (tra il 20 e il 40%). È possibile migliorarla con una migliore aerazione utilizzando l'agitazione orbitale a 150 giri/minuto o pompando aria sterile nel terreno di coltura, con 1 litro di aria per litro di terreno al minuto, oppure immobilizzando le cellule in perle di alginato. Si può cercare su youtube, è molto facile da fare e può aumentare notevolmente la resa.
Secondo metodo:
Questo protocollo è più avanzato, ma può aumentare la resa fino al 60 o 70% se eseguito correttamente. Tuttavia, richiede più materiale. Anche se non è perfetto, è molto meglio.
Questo metodo è stato progettato per il lievito Candida utilis invece che per S. cerevisiae. È possibile utilizzare il SC, ma la resa diminuirà. Potete acquistare il C. utilis qui: https://www.biomall.in/product/candida-utilis-atcc-9950-0779p-0779p
Procedura
Il terreno di coltura è composto da 10 g/L di urea (apporta azoto), 10 g/L di MgSO4 (apporta magnesio e zolfo) e da 50-70 g/L di zucchero, utilizzando la melassa. Sciogliere in un volume adeguato di tampone citrato 0,1 M pH 6.
Il giorno prima, inoculare una coltura iniziale di lievito e incubare a 30°C per tutta la notte.
Leggere la densità ottica (assorbanza) a 595 nm. Inoculare il reattore di fermentazione con il 15% v/v della coltura di partenza regolata a 0,4 OD. Esempio: per inoculare un contenitore da 1 litro, se la DO è stata misurata a 0,2, aggiungere 300 ml a 700 ml. Se la DO è già a 0,4, aggiungere 150mL a 850mL ecc... (240x106 cellule/ml nell'inoculo, vedi spiegazioni)
Incubare a 30°C con agitazione orbitale a 150 rpm o pompando aria sterile a 1 v/v/min. Se si pompa l'aria, si consiglia di aggiungere un'agitazione lenta.
Incubare fino a quando la DO non raggiunge un valore compreso tra 0,3 e 0,4. Dovrebbero essere necessarie dalle 4 alle 6 ore, ma possono essere di meno o di più. Controllare la DO ogni 30 minuti fino a raggiungere il valore desiderato.
L'aggiunta di benzaldeide avviene in dosi multiple. Per un campione di 50 ml, i volumi sono 68, 62, 56, 50, 43, 37, 31, 25. Aggiungere contemporaneamente un volume equivalente di acetaldeide. Attendere un'ora tra ogni aggiunta.
Estrarre con 1:2 toluene/media v/v, evaporare.
Spiegazione:
Densità ottica: si misura con uno spettrofotometro. Qui si legge l'assorbanza a 595 nm, che è proporzionale al numero di cellule in soluzione. Come regola empirica, ricordare 0,1 OD=60x10^6 cellule/mL.
Note generali:
Per l'aerazione, su piccola scala è meglio l'agitazione orbitale a 150 rpm. Su scala maggiore, è necessario far passare l'aria in bolle attraverso un filtro.
Nel secondo protocollo, l'aggiunta di benzaldeide viene effettuata in dosi multiple per aumentare la resa. La resa può essere ulteriormente migliorata iniettando continuamente benzaldeide in dosi decrescenti, ma questo è complesso da realizzare in un contesto amatoriale.
È possibile utilizzare benzaldeidi sostituite che produrranno l'analogo L-PAC corrispondente.
Infine, è possibile prendere in prestito alcuni elementi del metodo 2 e incorporarli nel metodo 1 per personalizzare il disegno sperimentale a proprio piacimento. Si tenga presente che è possibile utilizzare altri ceppi e specie, aumentando notevolmente le rese. Per ulteriori informazioni, si veda "Produzione di L-fenilacetilcarbinolo (L-PAC) da parte di diversi nuovi ceppi di lieviti in melassa e succo di canna da zucchero come mezzo di produzione" di Ravi et al.
Il L-fenilacetilcarbinolo è un composto utilizzato nella sintesi dell'efedrina, a sua volta utilizzata come precursore delle anfetamine. A livello industriale, viene sintetizzato dalla fermentazione aerobica della benzaldeide da parte del lievito di panetteria (S. cerevisiae/SC). Sebbene il processo sia abbastanza semplice, può richiedere un po' di attrezzature e conoscenze, soprattutto per quanto riguarda il mantenimento di colture sterili e condizioni di crescita adeguate. Vi illustrerò quindi due metodi di diversa complessità per la produzione di L-PAC attraverso la biotrasformazione. Il terreno di coltura deve essere sterilizzato in autoclave prima dell'uso.
Primo metodo:
Si potrebbe descrivere questa tecnica come "sciatta ma facile". Richiede meno attrezzature, è più facile, ma è anche meno efficace e darà luogo a rese inferiori.
Procedura:
In 500 ml di tampone citrato sterile 0,1 M pH 6 aggiungere 44 g di lievito e 55 g di glucosio. Mettere in un bagno d'acqua riscaldato a 30°C. Incubare per 40/50 minuti.
Aggiungere benzaldeide (25 mmol) in 5 mL di etanolo e acetaldeide (25 mmol). Incubare per 60 minuti.
Filtrare su Celite.
Estrarre con 3*100 ml di acetato di etile. Rompere l'emulsione con una soluzione satura di cloruro di sodio, asciugare su solfato di sodio anidro, filtrare e far evaporare il solvente. Questo è il vostro L-PAC.
Spiegazioni:
Tampone citrato: viene utilizzato per mantenere un pH stabile, poiché la crescita della cellula lo abbasserà nel tempo (non va bene). Per preparare questo tampone, seguire le procedure indicate da questa calcolatrice: https://www.aatbio.com/resources/buffer-preparations-and-recipes/citrate-buffer-ph-3-to-6-2. Non dimenticate di portare il pH a 6.
Temperatura: consente una maggiore attività metabolica del lievito.
Etanolo: utilizzato per sciogliere la benzaldeide e l'acetaldeide e per aumentarne la biodisponibilità.
Acetaldeide: utilizzata come accettore di idrogeno al posto della benzaldeide, limitando così la produzione di alcol benzilico.
Si tratta di una procedura facile che quasi tutti possono seguire dopo un po' di letture sulle tecniche sterili standard, ma che dà rese inferiori rispetto all'altra (tra il 20 e il 40%). È possibile migliorarla con una migliore aerazione utilizzando l'agitazione orbitale a 150 giri/minuto o pompando aria sterile nel terreno di coltura, con 1 litro di aria per litro di terreno al minuto, oppure immobilizzando le cellule in perle di alginato. Si può cercare su youtube, è molto facile da fare e può aumentare notevolmente la resa.
Secondo metodo:
Questo protocollo è più avanzato, ma può aumentare la resa fino al 60 o 70% se eseguito correttamente. Tuttavia, richiede più materiale. Anche se non è perfetto, è molto meglio.
Questo metodo è stato progettato per il lievito Candida utilis invece che per S. cerevisiae. È possibile utilizzare il SC, ma la resa diminuirà. Potete acquistare il C. utilis qui: https://www.biomall.in/product/candida-utilis-atcc-9950-0779p-0779p
Procedura
Il terreno di coltura è composto da 10 g/L di urea (apporta azoto), 10 g/L di MgSO4 (apporta magnesio e zolfo) e da 50-70 g/L di zucchero, utilizzando la melassa. Sciogliere in un volume adeguato di tampone citrato 0,1 M pH 6.
Il giorno prima, inoculare una coltura iniziale di lievito e incubare a 30°C per tutta la notte.
Leggere la densità ottica (assorbanza) a 595 nm. Inoculare il reattore di fermentazione con il 15% v/v della coltura di partenza regolata a 0,4 OD. Esempio: per inoculare un contenitore da 1 litro, se la DO è stata misurata a 0,2, aggiungere 300 ml a 700 ml. Se la DO è già a 0,4, aggiungere 150mL a 850mL ecc... (240x106 cellule/ml nell'inoculo, vedi spiegazioni)
Incubare a 30°C con agitazione orbitale a 150 rpm o pompando aria sterile a 1 v/v/min. Se si pompa l'aria, si consiglia di aggiungere un'agitazione lenta.
Incubare fino a quando la DO non raggiunge un valore compreso tra 0,3 e 0,4. Dovrebbero essere necessarie dalle 4 alle 6 ore, ma possono essere di meno o di più. Controllare la DO ogni 30 minuti fino a raggiungere il valore desiderato.
L'aggiunta di benzaldeide avviene in dosi multiple. Per un campione di 50 ml, i volumi sono 68, 62, 56, 50, 43, 37, 31, 25. Aggiungere contemporaneamente un volume equivalente di acetaldeide. Attendere un'ora tra ogni aggiunta.
Estrarre con 1:2 toluene/media v/v, evaporare.
Spiegazione:
Densità ottica: si misura con uno spettrofotometro. Qui si legge l'assorbanza a 595 nm, che è proporzionale al numero di cellule in soluzione. Come regola empirica, ricordare 0,1 OD=60x10^6 cellule/mL.
Note generali:
Per l'aerazione, su piccola scala è meglio l'agitazione orbitale a 150 rpm. Su scala maggiore, è necessario far passare l'aria in bolle attraverso un filtro.
Nel secondo protocollo, l'aggiunta di benzaldeide viene effettuata in dosi multiple per aumentare la resa. La resa può essere ulteriormente migliorata iniettando continuamente benzaldeide in dosi decrescenti, ma questo è complesso da realizzare in un contesto amatoriale.
È possibile utilizzare benzaldeidi sostituite che produrranno l'analogo L-PAC corrispondente.
Infine, è possibile prendere in prestito alcuni elementi del metodo 2 e incorporarli nel metodo 1 per personalizzare il disegno sperimentale a proprio piacimento. Si tenga presente che è possibile utilizzare altri ceppi e specie, aumentando notevolmente le rese. Per ulteriori informazioni, si veda "Produzione di L-fenilacetilcarbinolo (L-PAC) da parte di diversi nuovi ceppi di lieviti in melassa e succo di canna da zucchero come mezzo di produzione" di Ravi et al.
