Inleiding
L-fenylacetylcarbinol is een verbinding die gebruikt wordt bij de synthese van efedrine, dat zelf weer gebruikt wordt als voorloper van amfetaminen. Industrieel wordt het gesynthetiseerd door de aerobe fermentatie van benzaldehyde door bakkersgist (S. cerevisiae/SC). Hoewel het proces vrij eenvoudig is, kan het wat apparatuur en kennis vereisen, vooral als het gaat om het handhaven van steriele culturen en de juiste groeicondities. Ik zal daarom twee verschillende methoden uitleggen voor de productie van L-PAC door middel van biotransformatie. Het groeimedium moet voor gebruik worden gesteriliseerd door autoclaveren.
Eerste methode:
Je zou deze techniek kunnen omschrijven als "slordig maar gemakkelijk". Er is minder apparatuur voor nodig, het is gemakkelijker, maar het is ook minder effectief en zal resulteren in een lagere opbrengst.
Procedure:
Voeg in 500 ml steriele 0,1M pH 6 citraatbuffer 44 g gist en 55 g glucose toe. Plaats in een waterbad verwarmd op 30°C. Incubeer gedurende 40/50 minuten.
Voeg benzaldehyde (25 mmol) in 5 ml ethanol en acetaldehyde (25 mmol) toe. Incubeer gedurende 60 minuten.
Filtreer door Celiet.
Extraheer met 3*100 ml ethylacetaat. Breek de emulsie met een verzadigde natriumchlorideoplossing, droog boven watervrij natriumsulfaat, filtreer en verdamp het oplosmiddel. Dit is je L-PAC.
Uitleg:
Citraatbuffer: deze wordt gebruikt om de pH stabiel te houden, omdat deze door de groei van de cel steeds lager wordt (niet goed). Om deze buffer te bereiden, volg je de procedures van deze calculator: https://www.aatbio.com/resources/buffer-preparations-and-recipes/citrate-buffer-ph-3-to-6-2. Vergeet niet om de pH op 6 te zetten.
Temperatuur: zorgt voor een hogere metabolische activiteit van de gist.
Ethanol: wordt gebruikt om benzaldehyde en aceetaldehyde op te lossen en verhoogt hun biologische beschikbaarheid.
Acetaldehyde: gebruikt als waterstofacceptor in plaats van benzaldehyde, waardoor de productie van benzylalcohol wordt beperkt.
Dit is een eenvoudige procedure die bijna iedereen kan volgen na wat lezen over standaard steriele technieken, maar het geeft een lagere opbrengst dan de andere (tussen 20 en 40%). Het kan worden verbeterd door een betere beluchting met behulp van orbitaal schudden bij 150 rpm of door steriele lucht in het medium te pompen, met 1 liter lucht per liter medium per minuut, of door de cellen te immobiliseren in alginaatkorrels. Je kunt dit opzoeken op youtube, het is heel eenvoudig om te doen en kan de opbrengst aanzienlijk verhogen.
Tweede methode:
Dit protocol is geavanceerder, maar kan de opbrengst tot 60 of 70% verhogen als het correct wordt uitgevoerd. Er is echter meer materiaal voor nodig. Hoewel het niet perfect is, is het veel beter.
Deze methode is ontworpen voor de gist Candida utilis in plaats van S. cerevisiae. Je kunt in plaats daarvan SC gebruiken, maar je zult een lagere opbrengst zien. Je kunt C. utilis hier kopen: https://www.biomall.in/product/candida-utilis-atcc-9950-0779p-0779p
Procedure
Het groeimedium is samengesteld uit 10g/L ureum (brengt stikstof), 10g/L MgSO4 (brengt magnesium en zwavel) en tussen 50 en 70g/L suiker met behulp van melasse. Los op in een voldoende hoeveelheid 0,1M pH 6 citraatbuffer.
Inoculeer de dag ervoor een startcultuur van gist en incubeer bij 30°C gedurende de nacht.
Lees de optische dichtheid (absorptie) af bij 595nm. Inoculeer je fermentatiereactor met 15% v/v van je startcultuur aangepast tot 0,4 OD. Voorbeeld: om een 1L container te enten, als de OD is gemeten op 0,2, voeg dan 300 ml toe aan 700 ml. Als de OD al 0,4 is, voeg dan 150 ml toe aan 850 ml, enzovoort (240 x 106 cellen/ml in het inoculum, zie uitleg).
Incubeer bij 30°C met orbitaal schudden bij 150 rpm of steriele lucht pompen bij een snelheid van 1 v/v/min. Als je lucht verpompt, kun je misschien wat langzaam roeren toevoegen.
Incubeer tot de OD tussen 0,3 en 0,4 ligt. Dit zou tussen de 4 en 6 uur moeten duren, maar het kan ook korter of langer zijn. Controleer de OD elke 30 minuten totdat je de gewenste waarde hebt bereikt.
De toevoeging van benzaldehyde gebeurt in meerdere doses. Voor een 50 ml zijn de volumes 68, 62, 56, 50, 43, 37, 31, 25. Voeg tegelijkertijd een equivalent volume aceetaldehyde toe. Wacht een uur tussen elke toevoeging.
Extraheer met 1:2 tolueen/medium v/v en damp in.
Uitleg:
Optische dichtheid: deze wordt gemeten met een spectrofotometer. Hier lezen we de absorptie bij 595 nm af, die evenredig is met het aantal cellen in de oplossing. Als vuistregel geldt 0,1 OD=60x10^6 cellen/mL.
Algemene opmerkingen:
Voor beluchting is op kleine schaal orbitaal schudden bij 150 rpm beter. Op grotere schaal moet je lucht door een filter laten borrelen.
In het tweede protocol wordt de toevoeging van benzaldehyde gedaan in meerdere doses om de opbrengst te verhogen. Dit kan verder worden verbeterd door continu benzaldehyde in afnemende mate te injecteren, maar dit is complex om te doen in een amateursetting.
Gesubstitueerde benzaldehyden kunnen worden gebruikt en zullen het overeenkomstige L-PAC-analoog opleveren.
Tot slot kun je een aantal elementen van methode 2 lenen en opnemen in methode 1 om de proefopzet naar wens aan te passen. Wees je ervan bewust dat andere stammen en soorten kunnen worden gebruikt, waardoor de opbrengst sterk toeneemt. Zie "productie van L-fenylacetylcarbinol (L-PAC) door verschillende nieuwe giststammen in melasse en suikerrietsap als productiemedium" door Ravi et al voor meer informatie.
L-fenylacetylcarbinol is een verbinding die gebruikt wordt bij de synthese van efedrine, dat zelf weer gebruikt wordt als voorloper van amfetaminen. Industrieel wordt het gesynthetiseerd door de aerobe fermentatie van benzaldehyde door bakkersgist (S. cerevisiae/SC). Hoewel het proces vrij eenvoudig is, kan het wat apparatuur en kennis vereisen, vooral als het gaat om het handhaven van steriele culturen en de juiste groeicondities. Ik zal daarom twee verschillende methoden uitleggen voor de productie van L-PAC door middel van biotransformatie. Het groeimedium moet voor gebruik worden gesteriliseerd door autoclaveren.
Eerste methode:
Je zou deze techniek kunnen omschrijven als "slordig maar gemakkelijk". Er is minder apparatuur voor nodig, het is gemakkelijker, maar het is ook minder effectief en zal resulteren in een lagere opbrengst.
Procedure:
Voeg in 500 ml steriele 0,1M pH 6 citraatbuffer 44 g gist en 55 g glucose toe. Plaats in een waterbad verwarmd op 30°C. Incubeer gedurende 40/50 minuten.
Voeg benzaldehyde (25 mmol) in 5 ml ethanol en acetaldehyde (25 mmol) toe. Incubeer gedurende 60 minuten.
Filtreer door Celiet.
Extraheer met 3*100 ml ethylacetaat. Breek de emulsie met een verzadigde natriumchlorideoplossing, droog boven watervrij natriumsulfaat, filtreer en verdamp het oplosmiddel. Dit is je L-PAC.
Uitleg:
Citraatbuffer: deze wordt gebruikt om de pH stabiel te houden, omdat deze door de groei van de cel steeds lager wordt (niet goed). Om deze buffer te bereiden, volg je de procedures van deze calculator: https://www.aatbio.com/resources/buffer-preparations-and-recipes/citrate-buffer-ph-3-to-6-2. Vergeet niet om de pH op 6 te zetten.
Temperatuur: zorgt voor een hogere metabolische activiteit van de gist.
Ethanol: wordt gebruikt om benzaldehyde en aceetaldehyde op te lossen en verhoogt hun biologische beschikbaarheid.
Acetaldehyde: gebruikt als waterstofacceptor in plaats van benzaldehyde, waardoor de productie van benzylalcohol wordt beperkt.
Dit is een eenvoudige procedure die bijna iedereen kan volgen na wat lezen over standaard steriele technieken, maar het geeft een lagere opbrengst dan de andere (tussen 20 en 40%). Het kan worden verbeterd door een betere beluchting met behulp van orbitaal schudden bij 150 rpm of door steriele lucht in het medium te pompen, met 1 liter lucht per liter medium per minuut, of door de cellen te immobiliseren in alginaatkorrels. Je kunt dit opzoeken op youtube, het is heel eenvoudig om te doen en kan de opbrengst aanzienlijk verhogen.
Tweede methode:
Dit protocol is geavanceerder, maar kan de opbrengst tot 60 of 70% verhogen als het correct wordt uitgevoerd. Er is echter meer materiaal voor nodig. Hoewel het niet perfect is, is het veel beter.
Deze methode is ontworpen voor de gist Candida utilis in plaats van S. cerevisiae. Je kunt in plaats daarvan SC gebruiken, maar je zult een lagere opbrengst zien. Je kunt C. utilis hier kopen: https://www.biomall.in/product/candida-utilis-atcc-9950-0779p-0779p
Procedure
Het groeimedium is samengesteld uit 10g/L ureum (brengt stikstof), 10g/L MgSO4 (brengt magnesium en zwavel) en tussen 50 en 70g/L suiker met behulp van melasse. Los op in een voldoende hoeveelheid 0,1M pH 6 citraatbuffer.
Inoculeer de dag ervoor een startcultuur van gist en incubeer bij 30°C gedurende de nacht.
Lees de optische dichtheid (absorptie) af bij 595nm. Inoculeer je fermentatiereactor met 15% v/v van je startcultuur aangepast tot 0,4 OD. Voorbeeld: om een 1L container te enten, als de OD is gemeten op 0,2, voeg dan 300 ml toe aan 700 ml. Als de OD al 0,4 is, voeg dan 150 ml toe aan 850 ml, enzovoort (240 x 106 cellen/ml in het inoculum, zie uitleg).
Incubeer bij 30°C met orbitaal schudden bij 150 rpm of steriele lucht pompen bij een snelheid van 1 v/v/min. Als je lucht verpompt, kun je misschien wat langzaam roeren toevoegen.
Incubeer tot de OD tussen 0,3 en 0,4 ligt. Dit zou tussen de 4 en 6 uur moeten duren, maar het kan ook korter of langer zijn. Controleer de OD elke 30 minuten totdat je de gewenste waarde hebt bereikt.
De toevoeging van benzaldehyde gebeurt in meerdere doses. Voor een 50 ml zijn de volumes 68, 62, 56, 50, 43, 37, 31, 25. Voeg tegelijkertijd een equivalent volume aceetaldehyde toe. Wacht een uur tussen elke toevoeging.
Extraheer met 1:2 tolueen/medium v/v en damp in.
Uitleg:
Optische dichtheid: deze wordt gemeten met een spectrofotometer. Hier lezen we de absorptie bij 595 nm af, die evenredig is met het aantal cellen in de oplossing. Als vuistregel geldt 0,1 OD=60x10^6 cellen/mL.
Algemene opmerkingen:
Voor beluchting is op kleine schaal orbitaal schudden bij 150 rpm beter. Op grotere schaal moet je lucht door een filter laten borrelen.
In het tweede protocol wordt de toevoeging van benzaldehyde gedaan in meerdere doses om de opbrengst te verhogen. Dit kan verder worden verbeterd door continu benzaldehyde in afnemende mate te injecteren, maar dit is complex om te doen in een amateursetting.
Gesubstitueerde benzaldehyden kunnen worden gebruikt en zullen het overeenkomstige L-PAC-analoog opleveren.
Tot slot kun je een aantal elementen van methode 2 lenen en opnemen in methode 1 om de proefopzet naar wens aan te passen. Wees je ervan bewust dat andere stammen en soorten kunnen worden gebruikt, waardoor de opbrengst sterk toeneemt. Zie "productie van L-fenylacetylcarbinol (L-PAC) door verschillende nieuwe giststammen in melasse en suikerrietsap als productiemedium" door Ravi et al voor meer informatie.
