Introdução
O L-fenilacetilcarbinol é um composto usado na síntese da efedrina, que por sua vez é usada como precursora das anfetaminas. Industrialmente, ele é sintetizado pela fermentação aeróbica do benzaldeído pela levedura de padeiro (S. cerevisiae/SC). Embora o processo seja bastante simples, ele pode exigir um pouco de equipamento e conhecimento, especialmente quando se trata de manter culturas estéreis e condições de crescimento adequadas. Portanto, explicarei dois métodos de diferentes sofisticações para a produção de L-PAC por biotransformação. O meio de cultura deve ser esterilizado por autoclavagem antes do uso.
Primeiro método:
Pode-se descrever essa técnica como "desleixada, mas fácil". Ela requer menos equipamentos, é mais fácil, mas também é menos eficaz e resultará em rendimentos menores.
Procedimento:
Em 500 ml de tampão citrato 0,1M pH 6 estéril, adicione 44 g de levedura e 55 g de glicose. Coloque em um banho-maria aquecido a 30°C. Incubar por 40/50 minutos.
Adicione benzaldeído (25 mmol) em 5 mL de etanol e acetaldeído (25 mmol). Incubar por 60 minutos.
Filtre com Celite.
Extraia com 3*100 ml de acetato de etila. Quebre a emulsão usando uma solução saturada de cloreto de sódio, seque com sulfato de sódio anidro, filtre e evapore o solvente. Esse é o seu L-PAC.
Explicações:
Tampão de citrato: é usado para manter um pH estável, pois o crescimento da célula o reduzirá com o tempo (o que não é bom). Para preparar esse tampão, siga os procedimentos fornecidos por esta calculadora: https://www.aatbio.com/resources/buffer-preparations-and-recipes/citrate-buffer-ph-3-to-6-2. Não se esqueça de alterar o pH para 6.
Temperatura: permite maior atividade metabólica da levedura.
Etanol: usado para dissolver o benzaldeído e o acetaldeído e aumenta sua biodisponibilidade.
Acetaldeído: usado como aceptor de hidrogênio em vez de benzaldeído, limitando assim a produção de álcool benzílico.
Esse é um procedimento fácil que quase qualquer pessoa pode seguir depois de ler um pouco sobre técnicas estéreis padrão, mas oferece rendimentos menores do que o outro (entre 20 e 40%). Ele pode ser melhorado com uma melhor aeração usando agitação orbital a 150 rpm ou bombeando ar estéril para o meio, com 1 L de ar por litro de meio por minuto, ou imobilizando as células em esferas de alginato. Você pode pesquisar isso no YouTube, é muito fácil de fazer e pode aumentar significativamente os rendimentos.
Segundo método:
Esse protocolo é mais avançado, mas pode aumentar o rendimento em até 60 ou 70% se for feito corretamente. No entanto, ele exigirá mais material. Embora não seja perfeito, é muito melhor.
Esse método foi projetado para a levedura Candida utilis em vez de S. cerevisiae. Você pode usar SC em vez de S. cerevisiae, mas verá uma diminuição na produção. Você pode comprar a C. utilis aqui: https://www.biomall.in/product/candida-utilis-atcc-9950-0779p-0779p
Procedimento
O meio de crescimento é composto de 10g/L de ureia (fornece nitrogênio), 10g/L de MgSO4 (fornece magnésio e enxofre) e entre 50 e 70g/L de açúcar usando melaço. Dissolva em um volume adequado de tampão citrato 0,1M pH 6.
No dia anterior, inocule uma cultura inicial de levedura e incube a 30°C durante a noite.
Leia a densidade óptica (absorbância) a 595nm. Inocule seu reator de fermentação com 15% v/v de sua cultura inicial ajustada para 0,4 OD. Exemplo: para inocular um recipiente de 1L, se a DO foi medida em 0,2, adicione 300mL a 700mL. Se a DO já estiver em 0,4, adicione 150 ml a 850 ml etc. (240x106 células/ml no inóculo, veja as explicações)
Incubar a 30°C com agitação orbital a 150 rpm ou bombeamento de ar estéril a uma taxa de 1 v/v/min. Se estiver bombeando ar, talvez você queira adicionar um pouco de agitação lenta.
Incube até que a DO atinja entre 0,3 e 0,4. Isso deve levar de 4 a 6 horas, podendo ser menos ou mais. Verifique a DO a cada 30 minutos até atingir o valor desejado.
A adição de benzaldeído é feita em doses múltiplas. Para um volume de 50 ml, os volumes são 68, 62, 56, 50, 43, 37, 31, 25. Adicione um volume equivalente de acetaldeído ao mesmo tempo. Aguarde uma hora entre cada adição.
Faça a extração usando 1:2 de tolueno/médio v/v e evapore.
Explicação:
Densidade óptica: é medida usando um espectrofotômetro. Aqui lemos a absorbância a 595 nm, que é proporcional ao número de células na solução. Como regra geral, lembre-se de que 0,1 DO=60x10^6 células/mL
Observações gerais:
Para a aeração, em uma escala pequena, a agitação orbital a 150 rpm é melhor. Em uma escala maior, você precisará borbulhar ar passado por um filtro.
No segundo protocolo, a adição de benzaldeído é feita em doses múltiplas para aumentar o rendimento. Isso pode ser melhorado ainda mais com a injeção contínua de benzaldeído em taxa decrescente, mas isso é complexo de fazer em um ambiente amador.
Os benzaldeídos substituídos podem ser usados e produzirão o análogo correspondente de L-PAC.
Por fim, você pode pegar emprestado alguns elementos do método 2 e incorporá-los ao método 1 para personalizar o projeto experimental a seu gosto. Esteja ciente de que outras cepas e espécies podem ser usadas, aumentando consideravelmente os rendimentos. Consulte "Produção de L-fenil acetil carbinol (L-PAC) por diferentes cepas novas de leveduras em melaço e suco de cana-de-açúcar como meio de produção" por Ravi et al para obter mais informações.
O L-fenilacetilcarbinol é um composto usado na síntese da efedrina, que por sua vez é usada como precursora das anfetaminas. Industrialmente, ele é sintetizado pela fermentação aeróbica do benzaldeído pela levedura de padeiro (S. cerevisiae/SC). Embora o processo seja bastante simples, ele pode exigir um pouco de equipamento e conhecimento, especialmente quando se trata de manter culturas estéreis e condições de crescimento adequadas. Portanto, explicarei dois métodos de diferentes sofisticações para a produção de L-PAC por biotransformação. O meio de cultura deve ser esterilizado por autoclavagem antes do uso.
Primeiro método:
Pode-se descrever essa técnica como "desleixada, mas fácil". Ela requer menos equipamentos, é mais fácil, mas também é menos eficaz e resultará em rendimentos menores.
Procedimento:
Em 500 ml de tampão citrato 0,1M pH 6 estéril, adicione 44 g de levedura e 55 g de glicose. Coloque em um banho-maria aquecido a 30°C. Incubar por 40/50 minutos.
Adicione benzaldeído (25 mmol) em 5 mL de etanol e acetaldeído (25 mmol). Incubar por 60 minutos.
Filtre com Celite.
Extraia com 3*100 ml de acetato de etila. Quebre a emulsão usando uma solução saturada de cloreto de sódio, seque com sulfato de sódio anidro, filtre e evapore o solvente. Esse é o seu L-PAC.
Explicações:
Tampão de citrato: é usado para manter um pH estável, pois o crescimento da célula o reduzirá com o tempo (o que não é bom). Para preparar esse tampão, siga os procedimentos fornecidos por esta calculadora: https://www.aatbio.com/resources/buffer-preparations-and-recipes/citrate-buffer-ph-3-to-6-2. Não se esqueça de alterar o pH para 6.
Temperatura: permite maior atividade metabólica da levedura.
Etanol: usado para dissolver o benzaldeído e o acetaldeído e aumenta sua biodisponibilidade.
Acetaldeído: usado como aceptor de hidrogênio em vez de benzaldeído, limitando assim a produção de álcool benzílico.
Esse é um procedimento fácil que quase qualquer pessoa pode seguir depois de ler um pouco sobre técnicas estéreis padrão, mas oferece rendimentos menores do que o outro (entre 20 e 40%). Ele pode ser melhorado com uma melhor aeração usando agitação orbital a 150 rpm ou bombeando ar estéril para o meio, com 1 L de ar por litro de meio por minuto, ou imobilizando as células em esferas de alginato. Você pode pesquisar isso no YouTube, é muito fácil de fazer e pode aumentar significativamente os rendimentos.
Segundo método:
Esse protocolo é mais avançado, mas pode aumentar o rendimento em até 60 ou 70% se for feito corretamente. No entanto, ele exigirá mais material. Embora não seja perfeito, é muito melhor.
Esse método foi projetado para a levedura Candida utilis em vez de S. cerevisiae. Você pode usar SC em vez de S. cerevisiae, mas verá uma diminuição na produção. Você pode comprar a C. utilis aqui: https://www.biomall.in/product/candida-utilis-atcc-9950-0779p-0779p
Procedimento
O meio de crescimento é composto de 10g/L de ureia (fornece nitrogênio), 10g/L de MgSO4 (fornece magnésio e enxofre) e entre 50 e 70g/L de açúcar usando melaço. Dissolva em um volume adequado de tampão citrato 0,1M pH 6.
No dia anterior, inocule uma cultura inicial de levedura e incube a 30°C durante a noite.
Leia a densidade óptica (absorbância) a 595nm. Inocule seu reator de fermentação com 15% v/v de sua cultura inicial ajustada para 0,4 OD. Exemplo: para inocular um recipiente de 1L, se a DO foi medida em 0,2, adicione 300mL a 700mL. Se a DO já estiver em 0,4, adicione 150 ml a 850 ml etc. (240x106 células/ml no inóculo, veja as explicações)
Incubar a 30°C com agitação orbital a 150 rpm ou bombeamento de ar estéril a uma taxa de 1 v/v/min. Se estiver bombeando ar, talvez você queira adicionar um pouco de agitação lenta.
Incube até que a DO atinja entre 0,3 e 0,4. Isso deve levar de 4 a 6 horas, podendo ser menos ou mais. Verifique a DO a cada 30 minutos até atingir o valor desejado.
A adição de benzaldeído é feita em doses múltiplas. Para um volume de 50 ml, os volumes são 68, 62, 56, 50, 43, 37, 31, 25. Adicione um volume equivalente de acetaldeído ao mesmo tempo. Aguarde uma hora entre cada adição.
Faça a extração usando 1:2 de tolueno/médio v/v e evapore.
Explicação:
Densidade óptica: é medida usando um espectrofotômetro. Aqui lemos a absorbância a 595 nm, que é proporcional ao número de células na solução. Como regra geral, lembre-se de que 0,1 DO=60x10^6 células/mL
Observações gerais:
Para a aeração, em uma escala pequena, a agitação orbital a 150 rpm é melhor. Em uma escala maior, você precisará borbulhar ar passado por um filtro.
No segundo protocolo, a adição de benzaldeído é feita em doses múltiplas para aumentar o rendimento. Isso pode ser melhorado ainda mais com a injeção contínua de benzaldeído em taxa decrescente, mas isso é complexo de fazer em um ambiente amador.
Os benzaldeídos substituídos podem ser usados e produzirão o análogo correspondente de L-PAC.
Por fim, você pode pegar emprestado alguns elementos do método 2 e incorporá-los ao método 1 para personalizar o projeto experimental a seu gosto. Esteja ciente de que outras cepas e espécies podem ser usadas, aumentando consideravelmente os rendimentos. Consulte "Produção de L-fenil acetil carbinol (L-PAC) por diferentes cepas novas de leveduras em melaço e suco de cana-de-açúcar como meio de produção" por Ravi et al para obter mais informações.
