Introdução
O L-fenilacetilcarbinol é um composto utilizado na síntese da efedrina, ela própria utilizada como precursor das anfetaminas. Industrialmente, é sintetizado através da fermentação aeróbica do benzaldeído pela levedura de padeiro (S. cerevisiae/SC). Embora o processo seja bastante simples, pode exigir algum equipamento e conhecimentos, especialmente quando se trata de manter culturas estéreis e condições de crescimento adequadas. Por isso, vou explicar dois métodos de diferente sofisticação para a produção de L-PAC por biotransformação. O meio de cultura deve ser esterilizado por autoclavagem antes de ser utilizado.
Primeiro método:
Esta técnica pode ser descrita como "descuidada mas fácil". Requer menos equipamento, é mais fácil, mas também é menos eficaz e resultará em rendimentos mais baixos.
Procedimento:
Em 500 ml de tampão citrato 0,1M pH 6 estéril, adicionar 44 g de levedura e 55 g de glucose. Colocar num banho de água aquecido a 30°C. Incubar durante 40/50 minutos.
Adicionar benzaldeído (25 mmol) em 5 mL de etanol e acetaldeído (25 mmol). Incubar durante 60 minutos.
Filtrar através de Celite.
Extrair com 3*100 ml de acetato de etilo. Quebrar a emulsão com uma solução saturada de cloreto de sódio, secar com sulfato de sódio anidro, filtrar e evaporar o solvente. Este é o seu L-PAC.
Explicações:
Tampão citrato: é utilizado para manter um pH estável, uma vez que o crescimento da célula o fará baixar com o tempo (o que não é bom). Para preparar este tampão, siga os procedimentos indicados por esta calculadora: https://www.aatbio.com/resources/buffer-preparations-and-recipes/citrate-buffer-ph-3-to-6-2. Não se esqueça de alterar o pH para 6.
Temperatura: permite uma maior atividade metabólica da levedura.
Etanol: utilizado para dissolver o benzaldeído e o acetaldeído e aumentar a sua biodisponibilidade.
Acetaldeído: utilizado como acetor de hidrogénio em vez do benzaldeído, limitando assim a produção de álcool benzílico.
Este é um procedimento fácil que quase qualquer pessoa pode seguir depois de um pouco de leitura sobre técnicas estéreis padrão, mas dá rendimentos mais baixos do que o outro (entre 20 a 40%). Pode ser melhorado através de um melhor arejamento utilizando agitação orbital a 150 rpm ou bombeando ar estéril para o meio, com 1L de ar por litro de meio por minuto, ou imobilizando as células em esferas de alginato. Podes procurar isto no youtube, é muito fácil de fazer e pode aumentar significativamente os rendimentos.
Segundo método:
Este protocolo é mais avançado, mas pode aumentar os rendimentos até 60 ou 70% se for feito corretamente. No entanto, requer mais material. Apesar de não ser perfeito, é muito melhor.
Este método foi concebido para a levedura Candida utilis em vez de S. cerevisiae. Podes usar SC em vez de S. cerevisiae mas verás uma diminuição no rendimento. Podes comprar C. utilis aqui: https://www.biomall.in/product/candida-utilis-atcc-9950-0779p-0779p
Procedimento
O meio de crescimento é composto por 10g/L de ureia (fornece azoto), 10g/L de MgSO4 (fornece magnésio e enxofre) e entre 50 a 70g/L de açúcar, utilizando melaço. Dissolver num volume adequado de tampão citrato 0,1M pH 6.
No dia anterior, inocular uma cultura inicial de levedura e incubar a 30°C durante a noite.
Ler a densidade ótica (absorvância) a 595nm. Inocular o reator de fermentação com 15% v/v da cultura inicial ajustada a 0,4 OD. Exemplo: para inocular um recipiente de 1L, se a DO foi medida a 0,2, adicione 300mL a 700mL. Se a DO já estiver a 0,4, adicionar 150mL a 850mL, etc... (240x106 células/ml no inóculo, ver explicações)
Incubar a 30°C com agitação orbital a 150 rpm ou bombear ar estéril a uma taxa de 1 v/v/min. Se bombear ar, pode querer adicionar alguma agitação lenta.
Incubar até a DO atingir entre 0,3 e 0,4. Isto deve demorar entre 4 a 6 horas, podendo ser menos ou mais. Verifica a DO a cada 30 minutos até atingires o valor desejado.
A adição de benzaldeído é efectuada em doses múltiplas. Para um volume de 50 ml, os volumes são 68, 62, 56, 50, 43, 37, 31, 25. Adicionar um volume equivalente de acetaldeído ao mesmo tempo. Esperar uma hora entre cada adição.
Extrair com 1:2 tolueno/médio v/v e evaporar.
Explicação:
Densidade ótica: é medida com um espetrofotómetro. Neste caso, lê-se a absorvância a 595nm, que é proporcional ao número de células em solução. Como regra geral, lembre-se que 0,1 DO=60x10^6 células/mL
Notas gerais:
Para o arejamento, numa escala pequena, é melhor agitar orbitalmente a 150 rpm. Numa escala maior, será necessário borbulhar ar passado através de um filtro.
No segundo protocolo, a adição de benzaldeído é efectuada em doses múltiplas para aumentar os rendimentos. Isto pode ser melhorado através da injeção contínua de benzaldeído a uma taxa decrescente, mas isto é complexo de fazer num ambiente amador.
Podem ser utilizados benzaldeídos substituídos, que produzirão o análogo correspondente do L-PAC.
Finalmente, é possível utilizar alguns elementos do método 2 e incorporá-los no método 1, de modo a personalizar o desenho experimental a seu gosto. Tenha em atenção que podem ser utilizadas outras estirpes e espécies, aumentando consideravelmente os rendimentos. Ver "produção de L-fenil acetil carbinol (L-PAC) por diferentes estirpes novas de leveduras em melaço e sumo de cana de açúcar como meio de produção" por Ravi et al para mais informações.
O L-fenilacetilcarbinol é um composto utilizado na síntese da efedrina, ela própria utilizada como precursor das anfetaminas. Industrialmente, é sintetizado através da fermentação aeróbica do benzaldeído pela levedura de padeiro (S. cerevisiae/SC). Embora o processo seja bastante simples, pode exigir algum equipamento e conhecimentos, especialmente quando se trata de manter culturas estéreis e condições de crescimento adequadas. Por isso, vou explicar dois métodos de diferente sofisticação para a produção de L-PAC por biotransformação. O meio de cultura deve ser esterilizado por autoclavagem antes de ser utilizado.
Primeiro método:
Esta técnica pode ser descrita como "descuidada mas fácil". Requer menos equipamento, é mais fácil, mas também é menos eficaz e resultará em rendimentos mais baixos.
Procedimento:
Em 500 ml de tampão citrato 0,1M pH 6 estéril, adicionar 44 g de levedura e 55 g de glucose. Colocar num banho de água aquecido a 30°C. Incubar durante 40/50 minutos.
Adicionar benzaldeído (25 mmol) em 5 mL de etanol e acetaldeído (25 mmol). Incubar durante 60 minutos.
Filtrar através de Celite.
Extrair com 3*100 ml de acetato de etilo. Quebrar a emulsão com uma solução saturada de cloreto de sódio, secar com sulfato de sódio anidro, filtrar e evaporar o solvente. Este é o seu L-PAC.
Explicações:
Tampão citrato: é utilizado para manter um pH estável, uma vez que o crescimento da célula o fará baixar com o tempo (o que não é bom). Para preparar este tampão, siga os procedimentos indicados por esta calculadora: https://www.aatbio.com/resources/buffer-preparations-and-recipes/citrate-buffer-ph-3-to-6-2. Não se esqueça de alterar o pH para 6.
Temperatura: permite uma maior atividade metabólica da levedura.
Etanol: utilizado para dissolver o benzaldeído e o acetaldeído e aumentar a sua biodisponibilidade.
Acetaldeído: utilizado como acetor de hidrogénio em vez do benzaldeído, limitando assim a produção de álcool benzílico.
Este é um procedimento fácil que quase qualquer pessoa pode seguir depois de um pouco de leitura sobre técnicas estéreis padrão, mas dá rendimentos mais baixos do que o outro (entre 20 a 40%). Pode ser melhorado através de um melhor arejamento utilizando agitação orbital a 150 rpm ou bombeando ar estéril para o meio, com 1L de ar por litro de meio por minuto, ou imobilizando as células em esferas de alginato. Podes procurar isto no youtube, é muito fácil de fazer e pode aumentar significativamente os rendimentos.
Segundo método:
Este protocolo é mais avançado, mas pode aumentar os rendimentos até 60 ou 70% se for feito corretamente. No entanto, requer mais material. Apesar de não ser perfeito, é muito melhor.
Este método foi concebido para a levedura Candida utilis em vez de S. cerevisiae. Podes usar SC em vez de S. cerevisiae mas verás uma diminuição no rendimento. Podes comprar C. utilis aqui: https://www.biomall.in/product/candida-utilis-atcc-9950-0779p-0779p
Procedimento
O meio de crescimento é composto por 10g/L de ureia (fornece azoto), 10g/L de MgSO4 (fornece magnésio e enxofre) e entre 50 a 70g/L de açúcar, utilizando melaço. Dissolver num volume adequado de tampão citrato 0,1M pH 6.
No dia anterior, inocular uma cultura inicial de levedura e incubar a 30°C durante a noite.
Ler a densidade ótica (absorvância) a 595nm. Inocular o reator de fermentação com 15% v/v da cultura inicial ajustada a 0,4 OD. Exemplo: para inocular um recipiente de 1L, se a DO foi medida a 0,2, adicione 300mL a 700mL. Se a DO já estiver a 0,4, adicionar 150mL a 850mL, etc... (240x106 células/ml no inóculo, ver explicações)
Incubar a 30°C com agitação orbital a 150 rpm ou bombear ar estéril a uma taxa de 1 v/v/min. Se bombear ar, pode querer adicionar alguma agitação lenta.
Incubar até a DO atingir entre 0,3 e 0,4. Isto deve demorar entre 4 a 6 horas, podendo ser menos ou mais. Verifica a DO a cada 30 minutos até atingires o valor desejado.
A adição de benzaldeído é efectuada em doses múltiplas. Para um volume de 50 ml, os volumes são 68, 62, 56, 50, 43, 37, 31, 25. Adicionar um volume equivalente de acetaldeído ao mesmo tempo. Esperar uma hora entre cada adição.
Extrair com 1:2 tolueno/médio v/v e evaporar.
Explicação:
Densidade ótica: é medida com um espetrofotómetro. Neste caso, lê-se a absorvância a 595nm, que é proporcional ao número de células em solução. Como regra geral, lembre-se que 0,1 DO=60x10^6 células/mL
Notas gerais:
Para o arejamento, numa escala pequena, é melhor agitar orbitalmente a 150 rpm. Numa escala maior, será necessário borbulhar ar passado através de um filtro.
No segundo protocolo, a adição de benzaldeído é efectuada em doses múltiplas para aumentar os rendimentos. Isto pode ser melhorado através da injeção contínua de benzaldeído a uma taxa decrescente, mas isto é complexo de fazer num ambiente amador.
Podem ser utilizados benzaldeídos substituídos, que produzirão o análogo correspondente do L-PAC.
Finalmente, é possível utilizar alguns elementos do método 2 e incorporá-los no método 1, de modo a personalizar o desenho experimental a seu gosto. Tenha em atenção que podem ser utilizadas outras estirpes e espécies, aumentando consideravelmente os rendimentos. Ver "produção de L-fenil acetil carbinol (L-PAC) por diferentes estirpes novas de leveduras em melaço e sumo de cana de açúcar como meio de produção" por Ravi et al para mais informações.
