Inledning
L-fenylacetylkarbinol är en förening som används vid syntes av efedrin, som i sin tur används som en prekursor till amfetamin. Industriellt syntetiseras det genom aerob fermentering av bensaldehyd med bagerijäst (S. cerevisiae/SC). Även om processen är ganska enkel kan den kräva lite utrustning och kunskap, särskilt när man talar om att upprätthålla sterila kulturer och korrekta tillväxtförhållanden. Jag kommer därför att förklara två olika sofistikerade metoder för produktion av L-PAC genom biotransformation. Tillväxtmediet bör steriliseras genom autoklavering före användning.
Den första metoden:
Man skulle kunna beskriva denna teknik som "slarvig men enkel". Den kräver mindre utrustning, är enklare, men är också mindre effektiv och kommer att ge lägre utbyte.
Tillvägagångssätt:
I 500 ml steril 0,1 M pH 6 citratbuffert tillsätts 44 g jäst och 55 g glukos. Placera i ett vattenbad uppvärmt till 30°C. Inkubera i 40/50 minuter.
Tillsätt bensaldehyd (25 mmol) i 5 mL etanol och acetaldehyd (25 mmol). Inkubera i 60 minuter.
Filtrera genom Celite.
Extrahera med 3*100 ml etylacetat. Bryt emulsionen med mättad natriumkloridlösning, torka över vattenfritt natriumsulfat, filtrera, avdunsta lösningsmedlet. Detta är din L-PAC.
Förklaringar:
Citratbuffert: denna används för att upprätthålla ett stabilt pH-värde, eftersom cellens tillväxt kommer att sänka det över tiden (inte bra). För att förbereda denna buffert, följ de procedurer som ges av denna kalkylator: https://www.aatbio.com/resources/buffer-preparations-and-recipes/citrate-buffer-ph-3-to-6-2. Glöm inte att ändra pH-värdet till 6.
Temperatur: möjliggör högre metabolisk aktivitet hos jästen.
Etanol: används för att lösa upp bensaldehyden och acetaldehyden och ökar deras biotillgänglighet.
Acetaldehyd: används som väteacceptor i stället för bensaldehyd, vilket begränsar produktionen av bensylalkohol.
Detta är en enkel procedur som nästan vem som helst kan följa efter att ha läst lite om sterila standardtekniker, men ger lägre utbyte än den andra (mellan 20 och 40%). Det kan förbättras antingen genom bättre luftning med hjälp av antingen orbital skakning vid 150 rpm eller genom att pumpa steril luft in i mediet, med 1 liter luft per liter medium per minut, eller genom att immobilisera cellerna i alginatpärlor. Du kan kolla upp detta på youtube, det är mycket enkelt att göra och kan öka avkastningen avsevärt.
Andra metoden:
Detta protokoll är mer avancerat, men kan öka utbytet upp till 60 eller 70% om det görs korrekt. Det kommer dock att kräva mer material. Även om det inte är perfekt är det mycket bättre.
Den här metoden är utformad för jästen Candida utilis istället för S. cerevisiae. Du kan använda SC istället men du kommer att se en minskning av avkastningen. Du kan köpa C. utilis här: https://www.biomall.in/product/candida-utilis-atcc-9950-0779p-0779p
Tillvägagångssätt
Tillväxtmediet består av 10 g/L urea (tillför kväve), 10 g/L MgSO4 (tillför magnesium och svavel) och mellan 50 och 70 g/L socker från melass. Lös upp i en tillräcklig volym 0,1 M pH 6 citratbuffert.
Dagen innan, ympa en startkultur av jäst och inkubera vid 30°C över natten.
Läs av den optiska densiteten (absorbansen) vid 595 nm. Ympa din fermenteringsreaktor med 15% v/v av din startkultur justerad till 0,4 OD. Exempel: för att ympa en 1L behållare, om OD uppmättes till 0,2, tillsätt 300mL till 700mL. Om OD redan är 0,4, tillsätt 150 ml till 850 ml etc... (240x106 celler/ml i inokulumet, se förklaringar)
Inkubera vid 30°C med antingen orbital skakning vid 150 rpm eller pumpning av steril luft med 1 v/v/min. Om du pumpar luft kanske du vill lägga till lite långsam omrörning där.
Inkubera tills OD når mellan 0,3 och 0,4. Detta bör ta mellan 4 och 6 timmar, kan vara mindre eller mer. Kontrollera OD var 30: e minut tills du når önskat värde.
Tillsatsen av bensaldehyd görs i flera doser. För en 50mL är volymerna 68, 62, 56, 50, 43, 37, 31, 25. Tillsätt en motsvarande volym acetaldehyd samtidigt. Vänta en timme mellan varje tillsats.
Extrahera med 1:2 toluen/medium v/v, indunsta.
Förklaring:
Optisk densitet: mäts med hjälp av en spektrofotometer. Här läser vi av absorbansen vid 595 nm, som är proportionell mot antalet celler i lösningen. Som en tumregel, kom ihåg 0,1 OD=60x10^6 celler/mL
Allmänna anteckningar:
För luftning är orbital skakning i liten skala vid 150 rpm bättre. I större skala måste du bubbla luft som passerar genom ett filter.
I det andra protokollet görs tillsatsen av bensaldehyd i flera doser för att öka utbytet. Detta kan förbättras ytterligare genom att kontinuerligt injicera bensaldehyd i minskande hastighet, men detta är komplicerat att göra i en amatörmiljö.
Substituerade bensaldehyder kan användas och kommer att ge motsvarande L-PAC-analog.
Slutligen kan du låna några element i metod 2 och införliva dem i metod 1 för att anpassa experimentell design efter eget tycke. Var medveten om att andra stammar och arter kan användas, vilket kraftigt ökar avkastningen. Se "produktion av L-fenylacetylkarbinol (L-PAC) av olika nya jäststammar i melass och sockerrörsjuice som produktionsmedium" av Ravi et al för mer info.
L-fenylacetylkarbinol är en förening som används vid syntes av efedrin, som i sin tur används som en prekursor till amfetamin. Industriellt syntetiseras det genom aerob fermentering av bensaldehyd med bagerijäst (S. cerevisiae/SC). Även om processen är ganska enkel kan den kräva lite utrustning och kunskap, särskilt när man talar om att upprätthålla sterila kulturer och korrekta tillväxtförhållanden. Jag kommer därför att förklara två olika sofistikerade metoder för produktion av L-PAC genom biotransformation. Tillväxtmediet bör steriliseras genom autoklavering före användning.
Den första metoden:
Man skulle kunna beskriva denna teknik som "slarvig men enkel". Den kräver mindre utrustning, är enklare, men är också mindre effektiv och kommer att ge lägre utbyte.
Tillvägagångssätt:
I 500 ml steril 0,1 M pH 6 citratbuffert tillsätts 44 g jäst och 55 g glukos. Placera i ett vattenbad uppvärmt till 30°C. Inkubera i 40/50 minuter.
Tillsätt bensaldehyd (25 mmol) i 5 mL etanol och acetaldehyd (25 mmol). Inkubera i 60 minuter.
Filtrera genom Celite.
Extrahera med 3*100 ml etylacetat. Bryt emulsionen med mättad natriumkloridlösning, torka över vattenfritt natriumsulfat, filtrera, avdunsta lösningsmedlet. Detta är din L-PAC.
Förklaringar:
Citratbuffert: denna används för att upprätthålla ett stabilt pH-värde, eftersom cellens tillväxt kommer att sänka det över tiden (inte bra). För att förbereda denna buffert, följ de procedurer som ges av denna kalkylator: https://www.aatbio.com/resources/buffer-preparations-and-recipes/citrate-buffer-ph-3-to-6-2. Glöm inte att ändra pH-värdet till 6.
Temperatur: möjliggör högre metabolisk aktivitet hos jästen.
Etanol: används för att lösa upp bensaldehyden och acetaldehyden och ökar deras biotillgänglighet.
Acetaldehyd: används som väteacceptor i stället för bensaldehyd, vilket begränsar produktionen av bensylalkohol.
Detta är en enkel procedur som nästan vem som helst kan följa efter att ha läst lite om sterila standardtekniker, men ger lägre utbyte än den andra (mellan 20 och 40%). Det kan förbättras antingen genom bättre luftning med hjälp av antingen orbital skakning vid 150 rpm eller genom att pumpa steril luft in i mediet, med 1 liter luft per liter medium per minut, eller genom att immobilisera cellerna i alginatpärlor. Du kan kolla upp detta på youtube, det är mycket enkelt att göra och kan öka avkastningen avsevärt.
Andra metoden:
Detta protokoll är mer avancerat, men kan öka utbytet upp till 60 eller 70% om det görs korrekt. Det kommer dock att kräva mer material. Även om det inte är perfekt är det mycket bättre.
Den här metoden är utformad för jästen Candida utilis istället för S. cerevisiae. Du kan använda SC istället men du kommer att se en minskning av avkastningen. Du kan köpa C. utilis här: https://www.biomall.in/product/candida-utilis-atcc-9950-0779p-0779p
Tillvägagångssätt
Tillväxtmediet består av 10 g/L urea (tillför kväve), 10 g/L MgSO4 (tillför magnesium och svavel) och mellan 50 och 70 g/L socker från melass. Lös upp i en tillräcklig volym 0,1 M pH 6 citratbuffert.
Dagen innan, ympa en startkultur av jäst och inkubera vid 30°C över natten.
Läs av den optiska densiteten (absorbansen) vid 595 nm. Ympa din fermenteringsreaktor med 15% v/v av din startkultur justerad till 0,4 OD. Exempel: för att ympa en 1L behållare, om OD uppmättes till 0,2, tillsätt 300mL till 700mL. Om OD redan är 0,4, tillsätt 150 ml till 850 ml etc... (240x106 celler/ml i inokulumet, se förklaringar)
Inkubera vid 30°C med antingen orbital skakning vid 150 rpm eller pumpning av steril luft med 1 v/v/min. Om du pumpar luft kanske du vill lägga till lite långsam omrörning där.
Inkubera tills OD når mellan 0,3 och 0,4. Detta bör ta mellan 4 och 6 timmar, kan vara mindre eller mer. Kontrollera OD var 30: e minut tills du når önskat värde.
Tillsatsen av bensaldehyd görs i flera doser. För en 50mL är volymerna 68, 62, 56, 50, 43, 37, 31, 25. Tillsätt en motsvarande volym acetaldehyd samtidigt. Vänta en timme mellan varje tillsats.
Extrahera med 1:2 toluen/medium v/v, indunsta.
Förklaring:
Optisk densitet: mäts med hjälp av en spektrofotometer. Här läser vi av absorbansen vid 595 nm, som är proportionell mot antalet celler i lösningen. Som en tumregel, kom ihåg 0,1 OD=60x10^6 celler/mL
Allmänna anteckningar:
För luftning är orbital skakning i liten skala vid 150 rpm bättre. I större skala måste du bubbla luft som passerar genom ett filter.
I det andra protokollet görs tillsatsen av bensaldehyd i flera doser för att öka utbytet. Detta kan förbättras ytterligare genom att kontinuerligt injicera bensaldehyd i minskande hastighet, men detta är komplicerat att göra i en amatörmiljö.
Substituerade bensaldehyder kan användas och kommer att ge motsvarande L-PAC-analog.
Slutligen kan du låna några element i metod 2 och införliva dem i metod 1 för att anpassa experimentell design efter eget tycke. Var medveten om att andra stammar och arter kan användas, vilket kraftigt ökar avkastningen. Se "produktion av L-fenylacetylkarbinol (L-PAC) av olika nya jäststammar i melass och sockerrörsjuice som produktionsmedium" av Ravi et al för mer info.
