Giriş
L-fenilasetilkarbinol, efedrin sentezinde kullanılan ve kendisi de amfetaminlerin öncüsü olarak kullanılan bir bileşiktir. Endüstriyel olarak, benzaldehitin fırıncı mayası (S. cerevisiae/SC) tarafından aerobik fermantasyonu ile sentezlenir. Süreç oldukça basit olsa da, özellikle steril kültürlerin ve uygun büyüme koşullarının sürdürülmesi söz konusu olduğunda, biraz ekipman ve bilgi gerektirebilir. Bu nedenle, biyotransformasyon yoluyla L-PAC üretimi için farklı karmaşıklıktaki iki yöntemi açıklayacağım. Büyüme ortamı kullanılmadan önce otoklavlanarak sterilize edilmelidir.
Birinci yöntem:
Bu teknik "özensiz ama kolay" olarak tanımlanabilir. Daha az ekipman gerektirir, daha kolaydır, ancak aynı zamanda daha az etkilidir ve daha düşük verimle sonuçlanacaktır.
Prosedür:
500 ml steril 0.1M pH 6 sitrat tamponuna 44 g maya ve 55 g glikoz ekleyin. 30°C'de ısıtılmış bir su banyosuna yerleştirin. 40/50 dakika boyunca inkübe edin.
5 mL etanol içinde benzaldehit (25 mmol) ve asetaldehit (25 mmol) ekleyin. 60 dakika boyunca inkübe edin.
Celite üzerinden süzün.
3*100 ml etil asetat ile ekstrakte edin. Doymuş Sodyum Klorür çözeltisi kullanarak emülsiyonu kırın, susuz sodyum sülfat üzerinde kurutun, süzün, çözücüyü buharlaştırın. Bu sizin L-PAC'nizdir.
Açıklamalar:
Sitrat tamponu: Bu, hücrenin büyümesi zamanla pH'ı düşüreceğinden (iyi değil) pH'ı sabit tutmak için kullanılır. Bu tamponu hazırlamak için, bu hesaplayıcı tarafından verilen prosedürleri izleyin: https://www.aatbio.com/resources/buffer-preparations-and-recipes/citrate-buffer-ph-3-to-6-2. pH değerini 6 olarak değiştirmeyi unutmayın.
Sıcaklık: mayanın daha yüksek metabolik aktivitesini sağlar.
Etanol: benzaldehit ve asetaldehiti çözmek için kullanılır ve biyoyararlanımlarını artırır.
Asetaldehit: benzaldehit yerine hidrojen alıcısı olarak kullanılır, böylece benzil alkol üretimi sınırlanır.
Bu, standart steril teknikler hakkında biraz okuma yaptıktan sonra neredeyse herkesin takip edebileceği kolay bir prosedürdür, ancak diğerinden daha düşük verim verir (% 20 ila 40 arasında). Ya 150 rpm'de orbital çalkalama kullanarak ya da ortama steril hava pompalayarak, dakikada ortamın litresi başına 1L hava ile daha iyi havalandırma sağlayarak ya da hücreleri aljinat boncuklarında hareketsiz hale getirerek geliştirilebilir. Bunu youtube'da araştırabilirsiniz, yapması çok kolaydır ve verimi önemli ölçüde artırabilir.
İkinci yöntem:
Bu protokol daha ileri düzeydedir, ancak doğru şekilde yapılırsa verimi %60 veya 70'e kadar artırabilir. Ancak daha fazla malzeme gerektirecektir. Mükemmel olmasa da çok daha iyidir.
Bu yöntem S. cerevisiae yerine Candida utilis mayası için tasarlanmıştır. Bunun yerine SC kullanabilirsiniz ancak verimde bir düşüş göreceksiniz. C. utilis'i buradan satın alabilirsiniz: https://www.biomall.in/product/candida-utilis-atcc-9950-0779p-0779p
Prosedür
Büyüme ortamı 10g/L üre (azot getirir), 10g/L MgSO4 (magnezyum ve sülfür getirir) ve melas kullanılarak 50 ila 70g/L arasında şekerden oluşur. Yeterli hacimde 0.1M pH 6 sitrat tamponu içinde çözün.
Bir gün önce, başlangıç maya kültürünü aşılayın ve gece boyunca 30°C'de inkübe edin.
Optik yoğunluğu (absorbans) 595nm'de okuyun. Fermantasyon reaktörünüzü 0,4 OD'ye ayarlanmış başlangıç kültürünüzün %15 v/v'si ile inoküle edin. Örnek: 1L'lik bir kabı aşılamak için, OD 0,2 olarak ölçüldüyse, 700mL'ye 300mL ekleyin. OD zaten 0,4 ise, 850 mL'ye 150 mL ekleyin vb... (inokulumda 240x106 hücre/ml, açıklamalara bakın)
150 rpm'de orbital çalkalama veya 1 v/v/dak hızında steril hava pompalama ile 30°C'de inkübe edin. Hava pompalıyorsanız, araya biraz yavaş karıştırma eklemek isteyebilirsiniz.
OD 0,3 ile 0,4 arasına ulaşana kadar inkübe edin. Bu 4 ila 6 saat arasında sürmelidir, daha az veya daha fazla olabilir. İstediğiniz değere ulaşana kadar OD'yi her 30 dakikada bir kontrol edin.
Benzaldehit ilavesi çoklu dozlar halinde yapılır. 50 mL için hacimler 68, 62, 56, 50, 43, 37, 31, 25'tir. Aynı anda eşdeğer hacimde asetaldehit ekleyin. Her ekleme arasında bir saat bekleyin.
1:2 toluen/medium v/v kullanarak ekstrakte edin, buharlaştırın.
Açıklama:
Optik yoğunluk: spektrofotometre kullanılarak ölçülür. Burada, çözeltideki hücre sayısıyla orantılı olan 595nm'de absorbansı okuruz. Temel bir kural olarak, 0,1 OD=60x10^6 hücre/mL olduğunu unutmayın
Genel notlar:
Havalandırma için küçük ölçekte 150 rpm'de orbital çalkalama daha iyidir. Daha büyük ölçekte, bir filtreden geçirilen havayı kabarcıklandırmanız gerekecektir.
İkinci protokolde, verimi artırmak için benzaldehit ilavesi çoklu dozlarda yapılır. Bu, benzaldehitin azalan oranlarda sürekli olarak enjekte edilmesiyle daha da geliştirilebilir, ancak amatör bir ortamda bunu yapmak karmaşıktır.
Sübstitüe benzaldehitler kullanılabilir ve karşılık gelen L-PAC analoğunu verecektir.
Son olarak, deneysel tasarımı istediğiniz gibi özelleştirmek için yöntem 2'nin bazı unsurlarını ödünç alabilir ve bunları yöntem 1'e dahil edebilirsiniz. Diğer suşların ve türlerin kullanılabileceğini ve verimin büyük ölçüde artacağını unutmayın. Daha fazla bilgi için Ravi ve arkadaşlarının "melas ve şeker kamışı suyunda üretim ortamı olarak farklı yeni maya türleri ile L-fenil Asetil Karbinol (L-PAC) üretimi" adlı çalışmasına bakınız.
L-fenilasetilkarbinol, efedrin sentezinde kullanılan ve kendisi de amfetaminlerin öncüsü olarak kullanılan bir bileşiktir. Endüstriyel olarak, benzaldehitin fırıncı mayası (S. cerevisiae/SC) tarafından aerobik fermantasyonu ile sentezlenir. Süreç oldukça basit olsa da, özellikle steril kültürlerin ve uygun büyüme koşullarının sürdürülmesi söz konusu olduğunda, biraz ekipman ve bilgi gerektirebilir. Bu nedenle, biyotransformasyon yoluyla L-PAC üretimi için farklı karmaşıklıktaki iki yöntemi açıklayacağım. Büyüme ortamı kullanılmadan önce otoklavlanarak sterilize edilmelidir.
Birinci yöntem:
Bu teknik "özensiz ama kolay" olarak tanımlanabilir. Daha az ekipman gerektirir, daha kolaydır, ancak aynı zamanda daha az etkilidir ve daha düşük verimle sonuçlanacaktır.
Prosedür:
500 ml steril 0.1M pH 6 sitrat tamponuna 44 g maya ve 55 g glikoz ekleyin. 30°C'de ısıtılmış bir su banyosuna yerleştirin. 40/50 dakika boyunca inkübe edin.
5 mL etanol içinde benzaldehit (25 mmol) ve asetaldehit (25 mmol) ekleyin. 60 dakika boyunca inkübe edin.
Celite üzerinden süzün.
3*100 ml etil asetat ile ekstrakte edin. Doymuş Sodyum Klorür çözeltisi kullanarak emülsiyonu kırın, susuz sodyum sülfat üzerinde kurutun, süzün, çözücüyü buharlaştırın. Bu sizin L-PAC'nizdir.
Açıklamalar:
Sitrat tamponu: Bu, hücrenin büyümesi zamanla pH'ı düşüreceğinden (iyi değil) pH'ı sabit tutmak için kullanılır. Bu tamponu hazırlamak için, bu hesaplayıcı tarafından verilen prosedürleri izleyin: https://www.aatbio.com/resources/buffer-preparations-and-recipes/citrate-buffer-ph-3-to-6-2. pH değerini 6 olarak değiştirmeyi unutmayın.
Sıcaklık: mayanın daha yüksek metabolik aktivitesini sağlar.
Etanol: benzaldehit ve asetaldehiti çözmek için kullanılır ve biyoyararlanımlarını artırır.
Asetaldehit: benzaldehit yerine hidrojen alıcısı olarak kullanılır, böylece benzil alkol üretimi sınırlanır.
Bu, standart steril teknikler hakkında biraz okuma yaptıktan sonra neredeyse herkesin takip edebileceği kolay bir prosedürdür, ancak diğerinden daha düşük verim verir (% 20 ila 40 arasında). Ya 150 rpm'de orbital çalkalama kullanarak ya da ortama steril hava pompalayarak, dakikada ortamın litresi başına 1L hava ile daha iyi havalandırma sağlayarak ya da hücreleri aljinat boncuklarında hareketsiz hale getirerek geliştirilebilir. Bunu youtube'da araştırabilirsiniz, yapması çok kolaydır ve verimi önemli ölçüde artırabilir.
İkinci yöntem:
Bu protokol daha ileri düzeydedir, ancak doğru şekilde yapılırsa verimi %60 veya 70'e kadar artırabilir. Ancak daha fazla malzeme gerektirecektir. Mükemmel olmasa da çok daha iyidir.
Bu yöntem S. cerevisiae yerine Candida utilis mayası için tasarlanmıştır. Bunun yerine SC kullanabilirsiniz ancak verimde bir düşüş göreceksiniz. C. utilis'i buradan satın alabilirsiniz: https://www.biomall.in/product/candida-utilis-atcc-9950-0779p-0779p
Prosedür
Büyüme ortamı 10g/L üre (azot getirir), 10g/L MgSO4 (magnezyum ve sülfür getirir) ve melas kullanılarak 50 ila 70g/L arasında şekerden oluşur. Yeterli hacimde 0.1M pH 6 sitrat tamponu içinde çözün.
Bir gün önce, başlangıç maya kültürünü aşılayın ve gece boyunca 30°C'de inkübe edin.
Optik yoğunluğu (absorbans) 595nm'de okuyun. Fermantasyon reaktörünüzü 0,4 OD'ye ayarlanmış başlangıç kültürünüzün %15 v/v'si ile inoküle edin. Örnek: 1L'lik bir kabı aşılamak için, OD 0,2 olarak ölçüldüyse, 700mL'ye 300mL ekleyin. OD zaten 0,4 ise, 850 mL'ye 150 mL ekleyin vb... (inokulumda 240x106 hücre/ml, açıklamalara bakın)
150 rpm'de orbital çalkalama veya 1 v/v/dak hızında steril hava pompalama ile 30°C'de inkübe edin. Hava pompalıyorsanız, araya biraz yavaş karıştırma eklemek isteyebilirsiniz.
OD 0,3 ile 0,4 arasına ulaşana kadar inkübe edin. Bu 4 ila 6 saat arasında sürmelidir, daha az veya daha fazla olabilir. İstediğiniz değere ulaşana kadar OD'yi her 30 dakikada bir kontrol edin.
Benzaldehit ilavesi çoklu dozlar halinde yapılır. 50 mL için hacimler 68, 62, 56, 50, 43, 37, 31, 25'tir. Aynı anda eşdeğer hacimde asetaldehit ekleyin. Her ekleme arasında bir saat bekleyin.
1:2 toluen/medium v/v kullanarak ekstrakte edin, buharlaştırın.
Açıklama:
Optik yoğunluk: spektrofotometre kullanılarak ölçülür. Burada, çözeltideki hücre sayısıyla orantılı olan 595nm'de absorbansı okuruz. Temel bir kural olarak, 0,1 OD=60x10^6 hücre/mL olduğunu unutmayın
Genel notlar:
Havalandırma için küçük ölçekte 150 rpm'de orbital çalkalama daha iyidir. Daha büyük ölçekte, bir filtreden geçirilen havayı kabarcıklandırmanız gerekecektir.
İkinci protokolde, verimi artırmak için benzaldehit ilavesi çoklu dozlarda yapılır. Bu, benzaldehitin azalan oranlarda sürekli olarak enjekte edilmesiyle daha da geliştirilebilir, ancak amatör bir ortamda bunu yapmak karmaşıktır.
Sübstitüe benzaldehitler kullanılabilir ve karşılık gelen L-PAC analoğunu verecektir.
Son olarak, deneysel tasarımı istediğiniz gibi özelleştirmek için yöntem 2'nin bazı unsurlarını ödünç alabilir ve bunları yöntem 1'e dahil edebilirsiniz. Diğer suşların ve türlerin kullanılabileceğini ve verimin büyük ölçüde artacağını unutmayın. Daha fazla bilgi için Ravi ve arkadaşlarının "melas ve şeker kamışı suyunda üretim ortamı olarak farklı yeni maya türleri ile L-fenil Asetil Karbinol (L-PAC) üretimi" adlı çalışmasına bakınız.
