Introduction
Le L-phénylacétylcarbinol est un composé utilisé dans la synthèse de l'éphédrine, elle-même utilisée comme précurseur des amphétamines. Industriellement, il est synthétisé par la fermentation aérobie du benzaldéhyde par la levure de boulangerie (S. cerevisiae/SC). Bien que le processus soit assez simple, il peut nécessiter un peu d'équipement et de connaissances, surtout lorsqu'il s'agit de maintenir des cultures stériles et des conditions de croissance appropriées. Je vais donc expliquer deux méthodes de sophistication différente pour la production de L-PAC par biotransformation. Le milieu de croissance doit être stérilisé à l'autoclave avant d'être utilisé.
Première méthode :
On pourrait qualifier cette technique de "bâclée mais facile". Elle nécessite moins d'équipement, est plus facile, mais est également moins efficace et donnera des rendements plus faibles.
Procédure :
Dans 500 ml de tampon citrate 0,1 M pH 6 stérile, ajouter 44 g de levure et 55 g de glucose. Placer dans un bain-marie chauffé à 30°C. Incuber pendant 40/50 minutes.
Ajouter du benzaldéhyde (25 mmol) dans 5 ml d'éthanol et de l'acétaldéhyde (25 mmol). Incuber pendant 60 minutes.
Filtrer à l'aide de Celite.
Extraire avec 3*100 ml d'acétate d'éthyle. Casser l'émulsion à l'aide d'une solution de chlorure de sodium saturée, sécher sur du sulfate de sodium anhydre, filtrer, évaporer le solvant. Ceci est votre L-PAC.
Explications :
Tampon citrate : il est utilisé pour maintenir un pH stable, car la croissance de la cellule l'abaisse à la longue (ce qui n'est pas bon). Pour préparer ce tampon, suivez les procédures données par ce calculateur : https://www.aatbio.com/resources/buffer-preparations-and-recipes/citrate-buffer-ph-3-to-6-2. N'oubliez pas de modifier le pH à 6.
Température : permet une activité métabolique plus élevée de la levure.
Éthanol : utilisé pour dissoudre le benzaldéhyde et l'acétaldéhyde et augmenter leur biodisponibilité.
Acétaldéhyde : utilisé comme accepteur d'hydrogène à la place du benzaldéhyde, limitant ainsi la production d'alcool benzylique.
Il s'agit d'une procédure facile que presque tout le monde peut suivre après quelques lectures sur les techniques stériles standard, mais qui donne des rendements inférieurs à l'autre (entre 20 et 40 %). Elle peut être améliorée soit par une meilleure aération en utilisant une agitation orbitale à 150 rpm ou en pompant de l'air stérile dans le milieu, avec 1L d'air par litre de milieu par minute, soit en immobilisant les cellules dans des billes d'alginate. Vous pouvez regarder cela sur Youtube, c'est très facile à faire et cela peut augmenter les rendements de manière significative.
Deuxième méthode :
Ce protocole est plus avancé, mais peut augmenter les rendements jusqu'à 60 ou 70 % s'il est exécuté correctement. Il nécessite cependant plus de matériel. Même s'il n'est pas parfait, il est bien meilleur.
Cette méthode a été conçue pour la levure Candida utilis au lieu de S. cerevisiae. Vous pouvez utiliser SC à la place mais vous verrez une diminution des rendements. Vous pouvez acheter C. utilis ici : https://www.biomall.in/product/candida-utilis-atcc-9950-0779p-0779p
Procédure
Le milieu de croissance est composé de 10g/L d'urée (apporte l'azote), 10g/L de MgSO4 (apporte le magnésium et le soufre) et de 50 à 70g/L de sucre (mélasse). Dissoudre dans un volume adéquat de tampon citrate 0,1M pH 6.
La veille, ensemencer une culture de départ de levure et incuber à 30°C pendant la nuit.
Lire la densité optique (absorbance) à 595 nm. Inoculer votre réacteur de fermentation avec 15% v/v de votre culture de départ ajustée à 0,4 OD. Exemple : pour inoculer un récipient de 1L, si la densité optique a été mesurée à 0,2, ajouter 300mL à 700mL. Si la densité optique est déjà de 0,4, ajouter 150 ml à 850 ml, etc... (240x106 cellules/ml dans l'inoculum, voir explications).
Incuber à 30°C en agitant orbitalement à 150 rpm ou en pompant de l'air stérile à 1 v/v/min. Si vous pompez de l'air, vous pouvez ajouter une agitation lente.
Incuber jusqu'à ce que la densité optique atteigne entre 0,3 et 0,4. Cela devrait prendre entre 4 et 6 heures, mais cela peut être moins ou plus. Vérifiez la densité optique toutes les 30 minutes jusqu'à ce que vous atteigniez la valeur souhaitée.
L'ajout de benzaldéhyde se fait en doses multiples. Pour un volume de 50 ml, les volumes sont 68, 62, 56, 50, 43, 37, 31, 25. Ajouter en même temps un volume équivalent d'acétaldéhyde. Attendre une heure entre chaque ajout.
Extraire en utilisant 1:2 toluène/médium v/v, évaporer.
Explication :
Densité optique : elle est mesurée à l'aide d'un spectrophotomètre. Ici, nous lisons l'absorbance à 595nm, qui est proportionnelle au nombre de cellules dans la solution. En règle générale, la densité optique est de 0,1 = 60x10^6 cellules/mL.
Remarques générales :
Pour l'aération, à petite échelle, une agitation orbitale à 150 tours/minute est préférable. À plus grande échelle, vous aurez besoin de bulles d'air passées à travers un filtre.
Dans le deuxième protocole, l'ajout de benzaldéhyde se fait en doses multiples pour augmenter les rendements. Ce dernier peut être encore amélioré en injectant continuellement du benzaldéhyde à un taux décroissant, mais cela est complexe à réaliser dans un cadre amateur.
Des benzaldéhydes substitués peuvent être utilisés et donneront l'analogue L-PAC correspondant.
Enfin, vous pouvez emprunter certains éléments de la méthode 2 et les incorporer dans la méthode 1 afin de personnaliser le plan d'expérience à votre convenance. Sachez que d'autres souches et espèces peuvent être utilisées, ce qui augmente considérablement les rendements. Pour plus d'informations, voir "Production of L-phenyl Acetyl Carbinol (L-PAC) by different novel strains of yeasts in molasses and sugar cane juice as production medium" par Ravi et al.
Le L-phénylacétylcarbinol est un composé utilisé dans la synthèse de l'éphédrine, elle-même utilisée comme précurseur des amphétamines. Industriellement, il est synthétisé par la fermentation aérobie du benzaldéhyde par la levure de boulangerie (S. cerevisiae/SC). Bien que le processus soit assez simple, il peut nécessiter un peu d'équipement et de connaissances, surtout lorsqu'il s'agit de maintenir des cultures stériles et des conditions de croissance appropriées. Je vais donc expliquer deux méthodes de sophistication différente pour la production de L-PAC par biotransformation. Le milieu de croissance doit être stérilisé à l'autoclave avant d'être utilisé.
Première méthode :
On pourrait qualifier cette technique de "bâclée mais facile". Elle nécessite moins d'équipement, est plus facile, mais est également moins efficace et donnera des rendements plus faibles.
Procédure :
Dans 500 ml de tampon citrate 0,1 M pH 6 stérile, ajouter 44 g de levure et 55 g de glucose. Placer dans un bain-marie chauffé à 30°C. Incuber pendant 40/50 minutes.
Ajouter du benzaldéhyde (25 mmol) dans 5 ml d'éthanol et de l'acétaldéhyde (25 mmol). Incuber pendant 60 minutes.
Filtrer à l'aide de Celite.
Extraire avec 3*100 ml d'acétate d'éthyle. Casser l'émulsion à l'aide d'une solution de chlorure de sodium saturée, sécher sur du sulfate de sodium anhydre, filtrer, évaporer le solvant. Ceci est votre L-PAC.
Explications :
Tampon citrate : il est utilisé pour maintenir un pH stable, car la croissance de la cellule l'abaisse à la longue (ce qui n'est pas bon). Pour préparer ce tampon, suivez les procédures données par ce calculateur : https://www.aatbio.com/resources/buffer-preparations-and-recipes/citrate-buffer-ph-3-to-6-2. N'oubliez pas de modifier le pH à 6.
Température : permet une activité métabolique plus élevée de la levure.
Éthanol : utilisé pour dissoudre le benzaldéhyde et l'acétaldéhyde et augmenter leur biodisponibilité.
Acétaldéhyde : utilisé comme accepteur d'hydrogène à la place du benzaldéhyde, limitant ainsi la production d'alcool benzylique.
Il s'agit d'une procédure facile que presque tout le monde peut suivre après quelques lectures sur les techniques stériles standard, mais qui donne des rendements inférieurs à l'autre (entre 20 et 40 %). Elle peut être améliorée soit par une meilleure aération en utilisant une agitation orbitale à 150 rpm ou en pompant de l'air stérile dans le milieu, avec 1L d'air par litre de milieu par minute, soit en immobilisant les cellules dans des billes d'alginate. Vous pouvez regarder cela sur Youtube, c'est très facile à faire et cela peut augmenter les rendements de manière significative.
Deuxième méthode :
Ce protocole est plus avancé, mais peut augmenter les rendements jusqu'à 60 ou 70 % s'il est exécuté correctement. Il nécessite cependant plus de matériel. Même s'il n'est pas parfait, il est bien meilleur.
Cette méthode a été conçue pour la levure Candida utilis au lieu de S. cerevisiae. Vous pouvez utiliser SC à la place mais vous verrez une diminution des rendements. Vous pouvez acheter C. utilis ici : https://www.biomall.in/product/candida-utilis-atcc-9950-0779p-0779p
Procédure
Le milieu de croissance est composé de 10g/L d'urée (apporte l'azote), 10g/L de MgSO4 (apporte le magnésium et le soufre) et de 50 à 70g/L de sucre (mélasse). Dissoudre dans un volume adéquat de tampon citrate 0,1M pH 6.
La veille, ensemencer une culture de départ de levure et incuber à 30°C pendant la nuit.
Lire la densité optique (absorbance) à 595 nm. Inoculer votre réacteur de fermentation avec 15% v/v de votre culture de départ ajustée à 0,4 OD. Exemple : pour inoculer un récipient de 1L, si la densité optique a été mesurée à 0,2, ajouter 300mL à 700mL. Si la densité optique est déjà de 0,4, ajouter 150 ml à 850 ml, etc... (240x106 cellules/ml dans l'inoculum, voir explications).
Incuber à 30°C en agitant orbitalement à 150 rpm ou en pompant de l'air stérile à 1 v/v/min. Si vous pompez de l'air, vous pouvez ajouter une agitation lente.
Incuber jusqu'à ce que la densité optique atteigne entre 0,3 et 0,4. Cela devrait prendre entre 4 et 6 heures, mais cela peut être moins ou plus. Vérifiez la densité optique toutes les 30 minutes jusqu'à ce que vous atteigniez la valeur souhaitée.
L'ajout de benzaldéhyde se fait en doses multiples. Pour un volume de 50 ml, les volumes sont 68, 62, 56, 50, 43, 37, 31, 25. Ajouter en même temps un volume équivalent d'acétaldéhyde. Attendre une heure entre chaque ajout.
Extraire en utilisant 1:2 toluène/médium v/v, évaporer.
Explication :
Densité optique : elle est mesurée à l'aide d'un spectrophotomètre. Ici, nous lisons l'absorbance à 595nm, qui est proportionnelle au nombre de cellules dans la solution. En règle générale, la densité optique est de 0,1 = 60x10^6 cellules/mL.
Remarques générales :
Pour l'aération, à petite échelle, une agitation orbitale à 150 tours/minute est préférable. À plus grande échelle, vous aurez besoin de bulles d'air passées à travers un filtre.
Dans le deuxième protocole, l'ajout de benzaldéhyde se fait en doses multiples pour augmenter les rendements. Ce dernier peut être encore amélioré en injectant continuellement du benzaldéhyde à un taux décroissant, mais cela est complexe à réaliser dans un cadre amateur.
Des benzaldéhydes substitués peuvent être utilisés et donneront l'analogue L-PAC correspondant.
Enfin, vous pouvez emprunter certains éléments de la méthode 2 et les incorporer dans la méthode 1 afin de personnaliser le plan d'expérience à votre convenance. Sachez que d'autres souches et espèces peuvent être utilisées, ce qui augmente considérablement les rendements. Pour plus d'informations, voir "Production of L-phenyl Acetyl Carbinol (L-PAC) by different novel strains of yeasts in molasses and sugar cane juice as production medium" par Ravi et al.
