Wprowadzenie
L-fenyloacetylokarbinol jest związkiem wykorzystywanym w syntezie efedryny, która z kolei wykorzystywana jest jako prekursor amfetaminy. Przemysłowo jest on syntetyzowany w procesie tlenowej fermentacji benzaldehydu przez drożdże piekarskie (S. cerevisiae/SC). Chociaż proces ten jest dość prosty, może wymagać nieco sprzętu i wiedzy, zwłaszcza jeśli chodzi o utrzymanie sterylnych kultur i odpowiednich warunków wzrostu. Wyjaśnię zatem dwie metody o różnym stopniu zaawansowania do produkcji L-PAC poprzez biotransformację. Przed użyciem pożywkę należy wysterylizować w autoklawie.
Pierwsza metoda:
Można opisać tę technikę jako "niechlujną, ale łatwą". Wymaga mniej sprzętu, jest łatwiejsza, ale jest również mniej skuteczna i skutkuje niższą wydajnością.
Procedura:
Do 500 ml sterylnego buforu cytrynianowego 0,1 M pH 6 dodaj 44 g drożdży i 55 g glukozy. Umieścić w łaźni wodnej o temperaturze 30°C. Inkubować przez 40/50 minut.
Dodać benzaldehyd (25 mmol) w 5 ml etanolu i aldehyd octowy (25 mmol). Inkubować przez 60 minut.
Przefiltrować przez Celite.
Ekstrahować 3*100 ml octanu etylu. Rozbić emulsję za pomocą nasyconego roztworu chlorku sodu, wysuszyć nad bezwodnym siarczanem sodu, przefiltrować, odparować rozpuszczalnik. To jest twój L-PAC.
Objaśnienia:
Bufor cytrynianowy: jest używany do utrzymania stabilnego pH, ponieważ wzrost komórek obniży je z czasem (nie jest to dobre). Aby przygotować ten bufor, postępuj zgodnie z procedurami podanymi w tym kalkulatorze: https://www.aatbio.com/resources/buffer-preparations-and-recipes/citrate-buffer-ph-3-to-6-2. Nie zapomnij zmienić pH na 6.
Temperatura: umożliwia wyższą aktywność metaboliczną drożdży.
Etanol: używany do rozpuszczania benzaldehydu i aldehydu octowego oraz zwiększa ich biodostępność.
Aldehyd octowy: stosowany jako akceptor wodoru zamiast benzaldehydu, ograniczając w ten sposób produkcję alkoholu benzylowego.
Jest to łatwa procedura, którą prawie każdy może wykonać po odrobinie lektury na temat standardowych technik sterylnych, ale daje niższą wydajność niż druga (od 20 do 40%). Można ją ulepszyć poprzez lepsze napowietrzanie za pomocą wytrząsania orbitalnego przy 150 obr / min lub poprzez pompowanie sterylnego powietrza do pożywki, z 1 litrem powietrza na litr pożywki na minutę, lub poprzez unieruchomienie komórek w kulkach alginianowych. Można to sprawdzić na youtube, jest to bardzo proste i może znacznie zwiększyć wydajność.
Druga metoda:
Ten protokół jest bardziej zaawansowany, ale może zwiększyć wydajność do 60 lub 70%, jeśli zostanie wykonany prawidłowo. Wymaga jednak więcej materiału. Chociaż nie jest idealna, jest o wiele lepsza.
Metoda ta została zaprojektowana dla drożdży Candida utilis zamiast S. cerevisiae. Możesz użyć SC zamiast nich, ale zobaczysz spadek wydajności. Drożdże C. utilis można kupić tutaj: https://www.biomall.in/product/candida-utilis-atcc-9950-0779p-0779p
Procedura
Pożywka wzrostowa składa się z 10 g / l mocznika (dostarcza azot), 10 g / l MgSO4 (dostarcza magnez i siarkę) i od 50 do 70 g / l cukru z melasy. Rozpuścić w odpowiedniej objętości 0,1M buforu cytrynianowego pH 6.
Dzień wcześniej zaszczepić początkową kulturę drożdży i inkubować w temperaturze 30°C przez noc.
Odczytać gęstość optyczną (absorbancję) przy 595nm. Zaszczepić reaktor fermentacyjny 15% v/v kultury wyjściowej dostosowanej do 0,4 OD. Przykład: aby zaszczepić pojemnik o pojemności 1 l, jeśli OD zmierzono na poziomie 0,2, dodaj 300 ml do 700 ml. Jeśli OD wynosi już 0,4, dodaj 150 ml do 850 ml itd... (240x106 komórek/ml w inokulum, patrz objaśnienia).
Inkubować w temperaturze 30°C z wytrząsaniem orbitalnym przy 150 obr/min lub pompując sterylne powietrze z prędkością 1 v/v/min. W przypadku pompowania powietrza warto dodać powolne mieszanie.
Inkubować, aż OD osiągnie między 0,3 a 0,4. Powinno to zająć od 4 do 6 godzin, może być mniej lub więcej. Sprawdzaj OD co 30 minut, aż osiągniesz pożądaną wartość.
Dodawanie benzaldehydu odbywa się w wielu dawkach. Dla 50 ml objętości wynoszą 68, 62, 56, 50, 43, 37, 31, 25. Dodaj równoważną objętość aldehydu octowego w tym samym czasie. Odczekać godzinę pomiędzy każdym dodaniem.
Ekstrahować używając 1:2 toluen/medium v/v, odparować.
Wyjaśnienie:
Gęstość optyczna: jest mierzona za pomocą spektrofotometru. Tutaj odczytujemy absorbancję przy 595nm, która jest proporcjonalna do liczby komórek w roztworze. Zasadniczo należy pamiętać, że 0,1 OD=60x10^6 komórek/ml.
Uwagi ogólne:
Do napowietrzania na małą skalę lepsze jest wytrząsanie orbitalne przy 150 obr. Na większą skalę konieczne będzie przepuszczanie powietrza przez filtr.
W drugim protokole dodawanie benzaldehydu odbywa się w wielu dawkach w celu zwiększenia wydajności. Można to dodatkowo poprawić poprzez ciągłe wstrzykiwanie benzaldehydu w malejącym tempie, ale jest to skomplikowane do wykonania w warunkach amatorskich.
Można użyć podstawionych benzaldehydów, które dadzą odpowiedni analog L-PAC.
Wreszcie, można zapożyczyć niektóre elementy metody 2 i włączyć je do metody 1 w celu dostosowania projektu eksperymentalnego do własnych upodobań. Należy pamiętać, że można użyć innych szczepów i gatunków, znacznie zwiększając wydajność. Więcej informacji można znaleźć w artykule "Produkcja L-fenyloacetylokarbinolu (L-PAC) przez różne nowe szczepy drożdży w melasie i soku z trzciny cukrowej jako pożywce produkcyjnej" autorstwa Ravi et al.
L-fenyloacetylokarbinol jest związkiem wykorzystywanym w syntezie efedryny, która z kolei wykorzystywana jest jako prekursor amfetaminy. Przemysłowo jest on syntetyzowany w procesie tlenowej fermentacji benzaldehydu przez drożdże piekarskie (S. cerevisiae/SC). Chociaż proces ten jest dość prosty, może wymagać nieco sprzętu i wiedzy, zwłaszcza jeśli chodzi o utrzymanie sterylnych kultur i odpowiednich warunków wzrostu. Wyjaśnię zatem dwie metody o różnym stopniu zaawansowania do produkcji L-PAC poprzez biotransformację. Przed użyciem pożywkę należy wysterylizować w autoklawie.
Pierwsza metoda:
Można opisać tę technikę jako "niechlujną, ale łatwą". Wymaga mniej sprzętu, jest łatwiejsza, ale jest również mniej skuteczna i skutkuje niższą wydajnością.
Procedura:
Do 500 ml sterylnego buforu cytrynianowego 0,1 M pH 6 dodaj 44 g drożdży i 55 g glukozy. Umieścić w łaźni wodnej o temperaturze 30°C. Inkubować przez 40/50 minut.
Dodać benzaldehyd (25 mmol) w 5 ml etanolu i aldehyd octowy (25 mmol). Inkubować przez 60 minut.
Przefiltrować przez Celite.
Ekstrahować 3*100 ml octanu etylu. Rozbić emulsję za pomocą nasyconego roztworu chlorku sodu, wysuszyć nad bezwodnym siarczanem sodu, przefiltrować, odparować rozpuszczalnik. To jest twój L-PAC.
Objaśnienia:
Bufor cytrynianowy: jest używany do utrzymania stabilnego pH, ponieważ wzrost komórek obniży je z czasem (nie jest to dobre). Aby przygotować ten bufor, postępuj zgodnie z procedurami podanymi w tym kalkulatorze: https://www.aatbio.com/resources/buffer-preparations-and-recipes/citrate-buffer-ph-3-to-6-2. Nie zapomnij zmienić pH na 6.
Temperatura: umożliwia wyższą aktywność metaboliczną drożdży.
Etanol: używany do rozpuszczania benzaldehydu i aldehydu octowego oraz zwiększa ich biodostępność.
Aldehyd octowy: stosowany jako akceptor wodoru zamiast benzaldehydu, ograniczając w ten sposób produkcję alkoholu benzylowego.
Jest to łatwa procedura, którą prawie każdy może wykonać po odrobinie lektury na temat standardowych technik sterylnych, ale daje niższą wydajność niż druga (od 20 do 40%). Można ją ulepszyć poprzez lepsze napowietrzanie za pomocą wytrząsania orbitalnego przy 150 obr / min lub poprzez pompowanie sterylnego powietrza do pożywki, z 1 litrem powietrza na litr pożywki na minutę, lub poprzez unieruchomienie komórek w kulkach alginianowych. Można to sprawdzić na youtube, jest to bardzo proste i może znacznie zwiększyć wydajność.
Druga metoda:
Ten protokół jest bardziej zaawansowany, ale może zwiększyć wydajność do 60 lub 70%, jeśli zostanie wykonany prawidłowo. Wymaga jednak więcej materiału. Chociaż nie jest idealna, jest o wiele lepsza.
Metoda ta została zaprojektowana dla drożdży Candida utilis zamiast S. cerevisiae. Możesz użyć SC zamiast nich, ale zobaczysz spadek wydajności. Drożdże C. utilis można kupić tutaj: https://www.biomall.in/product/candida-utilis-atcc-9950-0779p-0779p
Procedura
Pożywka wzrostowa składa się z 10 g / l mocznika (dostarcza azot), 10 g / l MgSO4 (dostarcza magnez i siarkę) i od 50 do 70 g / l cukru z melasy. Rozpuścić w odpowiedniej objętości 0,1M buforu cytrynianowego pH 6.
Dzień wcześniej zaszczepić początkową kulturę drożdży i inkubować w temperaturze 30°C przez noc.
Odczytać gęstość optyczną (absorbancję) przy 595nm. Zaszczepić reaktor fermentacyjny 15% v/v kultury wyjściowej dostosowanej do 0,4 OD. Przykład: aby zaszczepić pojemnik o pojemności 1 l, jeśli OD zmierzono na poziomie 0,2, dodaj 300 ml do 700 ml. Jeśli OD wynosi już 0,4, dodaj 150 ml do 850 ml itd... (240x106 komórek/ml w inokulum, patrz objaśnienia).
Inkubować w temperaturze 30°C z wytrząsaniem orbitalnym przy 150 obr/min lub pompując sterylne powietrze z prędkością 1 v/v/min. W przypadku pompowania powietrza warto dodać powolne mieszanie.
Inkubować, aż OD osiągnie między 0,3 a 0,4. Powinno to zająć od 4 do 6 godzin, może być mniej lub więcej. Sprawdzaj OD co 30 minut, aż osiągniesz pożądaną wartość.
Dodawanie benzaldehydu odbywa się w wielu dawkach. Dla 50 ml objętości wynoszą 68, 62, 56, 50, 43, 37, 31, 25. Dodaj równoważną objętość aldehydu octowego w tym samym czasie. Odczekać godzinę pomiędzy każdym dodaniem.
Ekstrahować używając 1:2 toluen/medium v/v, odparować.
Wyjaśnienie:
Gęstość optyczna: jest mierzona za pomocą spektrofotometru. Tutaj odczytujemy absorbancję przy 595nm, która jest proporcjonalna do liczby komórek w roztworze. Zasadniczo należy pamiętać, że 0,1 OD=60x10^6 komórek/ml.
Uwagi ogólne:
Do napowietrzania na małą skalę lepsze jest wytrząsanie orbitalne przy 150 obr. Na większą skalę konieczne będzie przepuszczanie powietrza przez filtr.
W drugim protokole dodawanie benzaldehydu odbywa się w wielu dawkach w celu zwiększenia wydajności. Można to dodatkowo poprawić poprzez ciągłe wstrzykiwanie benzaldehydu w malejącym tempie, ale jest to skomplikowane do wykonania w warunkach amatorskich.
Można użyć podstawionych benzaldehydów, które dadzą odpowiedni analog L-PAC.
Wreszcie, można zapożyczyć niektóre elementy metody 2 i włączyć je do metody 1 w celu dostosowania projektu eksperymentalnego do własnych upodobań. Należy pamiętać, że można użyć innych szczepów i gatunków, znacznie zwiększając wydajność. Więcej informacji można znaleźć w artykule "Produkcja L-fenyloacetylokarbinolu (L-PAC) przez różne nowe szczepy drożdży w melasie i soku z trzciny cukrowej jako pożywce produkcyjnej" autorstwa Ravi et al.
