Introducere
L-fenilacetilcarbinolul este un compus utilizat în sinteza efedrinei, ea însăși utilizată ca precursor al amfetaminelor. Industrial, acesta este sintetizat prin fermentarea aerobă a benzaldehidei de către drojdia de panificație (S. cerevisiae/SC). Deși procesul este destul de simplu, acesta poate necesita un pic de echipament și cunoștințe, în special în ceea ce privește menținerea culturilor sterile și a condițiilor de creștere adecvate. Prin urmare, voi explica două metode de sofisticare diferită pentru producerea de L-PAC prin biotransformare. Mediul de creștere trebuie să fie sterilizat prin autoclavare înainte de utilizare.
Prima metodă:
Această tehnică ar putea fi descrisă drept "neglijentă, dar ușoară". Aceasta necesită mai puțin echipament, este mai ușoară, dar este, de asemenea, mai puțin eficientă și va duce la randamente mai scăzute.
Procedură:
În 500 ml de tampon citrat steril 0,1M pH 6 se adaugă 44 g de drojdie și 55 g de glucoză. Se pune într-o baie de apă încălzită la 30 °C. Se incubează timp de 40/50 de minute.
Se adaugă benzaldehidă (25 mmol) în 5 ml etanol și acetaldehidă (25 mmol). Se incubează timp de 60 de minute.
Se filtrează prin Celite.
Se extrage cu 3*100 ml acetat de etil. Se rupe emulsia folosind soluție saturată de clorură de sodiu, se usucă pe sulfat de sodiu anhidru, se filtrează, se evaporă solventul. Acesta este L-PAC-ul dumneavoastră.
Explicații:
Tampon citrat: se utilizează pentru a menține un pH stabil, deoarece creșterea celulei îl va reduce în timp (nu este bine). Pentru a prepara acest tampon, urmați procedurile oferite de acest calculator: https://www.aatbio.com/resources/buffer-preparations-and-recipes/citrate-buffer-ph-3-to-6-2. Nu uitați să modificați pH-ul la 6.
Temperatura: permite creșterea activității metabolice a drojdiei.
Etanol: utilizat pentru dizolvarea benzaldehidei și a acetaldehidei și crește biodisponibilitatea acestora.
Acetaldehidă: utilizată ca acceptor de hidrogen în locul benzaldehidei, limitând astfel producția de alcool benzilic.
Aceasta este o procedură ușoară pe care aproape oricine o poate urma după ce a citit puțin despre tehnicile sterile standard, dar oferă randamente mai scăzute decât cealaltă (între 20 și 40 %). Aceasta poate fi îmbunătățită fie printr-o aerare mai bună prin agitare orbitală la 150 rpm sau prin pomparea de aer steril în mediu, cu 1 l de aer pe litru de mediu pe minut, fie prin imobilizarea celulelor în bile de alginat. Puteți căuta acest lucru pe youtube, este foarte ușor de realizat și poate crește semnificativ randamentul.
A doua metodă:
Acest protocol este mai avansat, dar poate crește randamentul până la 60 sau 70% dacă este realizat corect. Cu toate acestea, va necesita mai mult material. Chiar dacă nu este perfectă, este mult mai bună.
Această metodă a fost concepută pentru drojdia Candida utilis în loc de S. cerevisiae. Puteți folosi SC în schimb, dar veți observa o scădere a randamentelor. Puteți cumpăra C. utilis aici: https://www.biomall.in/product/candida-utilis-atcc-9950-0779p-0779p
Procedură
Mediul de creștere este compus din 10g/L uree (aduce azot), 10g/L MgSO4 (aduce magneziu și sulf) și între 50 și 70g/L de zahăr folosind melasă. Se dizolvă într-un volum adecvat de tampon citrat 0,1M pH 6.
Cu o zi înainte, inoculați o cultură inițială de drojdie și incubați la 30°C peste noapte.
Se citește densitatea optică (absorbția) la 595nm. Inoculați reactorul de fermentare cu 15% v/v din cultura inițială ajustată la 0,4 OD. Exemplu: pentru inocularea unui recipient de 1L, dacă DO a fost măsurată la 0,2, adăugați 300mL la 700mL. Dacă OD este deja la 0,4, adăugați 150mL la 850mL etc... (240x106 celule/ml în inocul, a se vedea explicațiile)
Incubați la 30 °C, fie cu agitare orbitală la 150 rpm, fie pompând aer steril la o viteză de 1 v/v/min. În cazul pompării aerului, este posibil să doriți să adăugați o agitare lentă.
Incubați până când OD ajunge între 0,3 și 0,4. Acest lucru ar trebui să dureze între 4 și 6 ore, poate fi mai puțin sau mai mult. Verificați DO la fiecare 30 de minute până când atingeți valoarea dorită.
Adăugarea benzaldehidei se face în doze multiple. Pentru un 50mL, volumele sunt 68, 62, 56, 50, 43, 37, 31, 25. Se adaugă un volum echivalent de acetaldehidă în același timp. Se așteaptă o oră între fiecare adăugare.
Se extrage folosind 1:2 toluen/mediu v/v, se evaporă.
Explicație:
Densitatea optică: se măsoară cu ajutorul unui spectrofotometru. Aici citim absorbanța la 595nm, care este proporțională cu numărul de celule din soluție. Ca regulă generală, rețineți 0,1 OD=60x10^6 celule/mL
Note generale:
Pentru aerare, la scară mică este mai bună agitarea orbitală la 150 rpm. La o scară mai mare, va trebui să bubuiți aer trecut printr-un filtru.
În al doilea protocol, adăugarea de benzaldehidă se face în doze multiple pentru a crește randamentul. Aceasta poate fi îmbunătățită și mai mult prin injectarea continuă de benzaldehidă în rate descrescătoare, dar acest lucru este complex de realizat într-un cadru amator.
Se pot utiliza benzaldehide substituite și se va obține analogul L-PAC corespunzător.
În cele din urmă, puteți împrumuta unele elemente din metoda 2 și le puteți încorpora în metoda 1 pentru a personaliza proiectul experimental după bunul plac. Fiți conștienți de faptul că pot fi utilizate alte tulpini și specii, ceea ce crește foarte mult randamentele. Pentru mai multe informații, consultați "producția de L-fenil acetil carbinol (L-PAC) de către diferite tulpini noi de drojdii în melasă și suc de trestie de zahăr ca mediu de producție" de Ravi et al.
L-fenilacetilcarbinolul este un compus utilizat în sinteza efedrinei, ea însăși utilizată ca precursor al amfetaminelor. Industrial, acesta este sintetizat prin fermentarea aerobă a benzaldehidei de către drojdia de panificație (S. cerevisiae/SC). Deși procesul este destul de simplu, acesta poate necesita un pic de echipament și cunoștințe, în special în ceea ce privește menținerea culturilor sterile și a condițiilor de creștere adecvate. Prin urmare, voi explica două metode de sofisticare diferită pentru producerea de L-PAC prin biotransformare. Mediul de creștere trebuie să fie sterilizat prin autoclavare înainte de utilizare.
Prima metodă:
Această tehnică ar putea fi descrisă drept "neglijentă, dar ușoară". Aceasta necesită mai puțin echipament, este mai ușoară, dar este, de asemenea, mai puțin eficientă și va duce la randamente mai scăzute.
Procedură:
În 500 ml de tampon citrat steril 0,1M pH 6 se adaugă 44 g de drojdie și 55 g de glucoză. Se pune într-o baie de apă încălzită la 30 °C. Se incubează timp de 40/50 de minute.
Se adaugă benzaldehidă (25 mmol) în 5 ml etanol și acetaldehidă (25 mmol). Se incubează timp de 60 de minute.
Se filtrează prin Celite.
Se extrage cu 3*100 ml acetat de etil. Se rupe emulsia folosind soluție saturată de clorură de sodiu, se usucă pe sulfat de sodiu anhidru, se filtrează, se evaporă solventul. Acesta este L-PAC-ul dumneavoastră.
Explicații:
Tampon citrat: se utilizează pentru a menține un pH stabil, deoarece creșterea celulei îl va reduce în timp (nu este bine). Pentru a prepara acest tampon, urmați procedurile oferite de acest calculator: https://www.aatbio.com/resources/buffer-preparations-and-recipes/citrate-buffer-ph-3-to-6-2. Nu uitați să modificați pH-ul la 6.
Temperatura: permite creșterea activității metabolice a drojdiei.
Etanol: utilizat pentru dizolvarea benzaldehidei și a acetaldehidei și crește biodisponibilitatea acestora.
Acetaldehidă: utilizată ca acceptor de hidrogen în locul benzaldehidei, limitând astfel producția de alcool benzilic.
Aceasta este o procedură ușoară pe care aproape oricine o poate urma după ce a citit puțin despre tehnicile sterile standard, dar oferă randamente mai scăzute decât cealaltă (între 20 și 40 %). Aceasta poate fi îmbunătățită fie printr-o aerare mai bună prin agitare orbitală la 150 rpm sau prin pomparea de aer steril în mediu, cu 1 l de aer pe litru de mediu pe minut, fie prin imobilizarea celulelor în bile de alginat. Puteți căuta acest lucru pe youtube, este foarte ușor de realizat și poate crește semnificativ randamentul.
A doua metodă:
Acest protocol este mai avansat, dar poate crește randamentul până la 60 sau 70% dacă este realizat corect. Cu toate acestea, va necesita mai mult material. Chiar dacă nu este perfectă, este mult mai bună.
Această metodă a fost concepută pentru drojdia Candida utilis în loc de S. cerevisiae. Puteți folosi SC în schimb, dar veți observa o scădere a randamentelor. Puteți cumpăra C. utilis aici: https://www.biomall.in/product/candida-utilis-atcc-9950-0779p-0779p
Procedură
Mediul de creștere este compus din 10g/L uree (aduce azot), 10g/L MgSO4 (aduce magneziu și sulf) și între 50 și 70g/L de zahăr folosind melasă. Se dizolvă într-un volum adecvat de tampon citrat 0,1M pH 6.
Cu o zi înainte, inoculați o cultură inițială de drojdie și incubați la 30°C peste noapte.
Se citește densitatea optică (absorbția) la 595nm. Inoculați reactorul de fermentare cu 15% v/v din cultura inițială ajustată la 0,4 OD. Exemplu: pentru inocularea unui recipient de 1L, dacă DO a fost măsurată la 0,2, adăugați 300mL la 700mL. Dacă OD este deja la 0,4, adăugați 150mL la 850mL etc... (240x106 celule/ml în inocul, a se vedea explicațiile)
Incubați la 30 °C, fie cu agitare orbitală la 150 rpm, fie pompând aer steril la o viteză de 1 v/v/min. În cazul pompării aerului, este posibil să doriți să adăugați o agitare lentă.
Incubați până când OD ajunge între 0,3 și 0,4. Acest lucru ar trebui să dureze între 4 și 6 ore, poate fi mai puțin sau mai mult. Verificați DO la fiecare 30 de minute până când atingeți valoarea dorită.
Adăugarea benzaldehidei se face în doze multiple. Pentru un 50mL, volumele sunt 68, 62, 56, 50, 43, 37, 31, 25. Se adaugă un volum echivalent de acetaldehidă în același timp. Se așteaptă o oră între fiecare adăugare.
Se extrage folosind 1:2 toluen/mediu v/v, se evaporă.
Explicație:
Densitatea optică: se măsoară cu ajutorul unui spectrofotometru. Aici citim absorbanța la 595nm, care este proporțională cu numărul de celule din soluție. Ca regulă generală, rețineți 0,1 OD=60x10^6 celule/mL
Note generale:
Pentru aerare, la scară mică este mai bună agitarea orbitală la 150 rpm. La o scară mai mare, va trebui să bubuiți aer trecut printr-un filtru.
În al doilea protocol, adăugarea de benzaldehidă se face în doze multiple pentru a crește randamentul. Aceasta poate fi îmbunătățită și mai mult prin injectarea continuă de benzaldehidă în rate descrescătoare, dar acest lucru este complex de realizat într-un cadru amator.
Se pot utiliza benzaldehide substituite și se va obține analogul L-PAC corespunzător.
În cele din urmă, puteți împrumuta unele elemente din metoda 2 și le puteți încorpora în metoda 1 pentru a personaliza proiectul experimental după bunul plac. Fiți conștienți de faptul că pot fi utilizate alte tulpini și specii, ceea ce crește foarte mult randamentele. Pentru mai multe informații, consultați "producția de L-fenil acetil carbinol (L-PAC) de către diferite tulpini noi de drojdii în melasă și suc de trestie de zahăr ca mediu de producție" de Ravi et al.
